秀麗線蟲生殖細(xì)胞凋亡檢測(cè)

四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)告題目：麗蟲生殖胞亡檢測(cè)一．實(shí)目的1.2.

掌握檢測(cè)凋亡細(xì)胞的法學(xué)習(xí)使用熒光染料活染色的方法和步驟二．實(shí)原理1.秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditiselegans一種無(wú)毒無(wú)害可以獨(dú)立生存的線蟲。個(gè)體小，成體僅1.5mm長(zhǎng)，為雌雄同（hermaphrodites個(gè)體僅占群體的可自體受精或性生殖；在下均生活史為3.5天，平均繁殖力為300-350個(gè)；但若與雄蟲交配可產(chǎn)生多達(dá)以上的后代。1976年，SulstonHorvitz利秀麗隱桿線（Caenorhabditiselegans）研究發(fā)現(xiàn)其約13%體細(xì)胞在胚胎發(fā)育中注定死亡使得人們識(shí)到細(xì)胞凋亡的遺傳礎(chǔ)。2.熒光染料活體染色本實(shí)驗(yàn)使用吖啶橙（Acridineorange為染色劑該染料對(duì)細(xì)具有慢性毒性致癌性強(qiáng)由于凋亡細(xì)胞DNA片段化可結(jié)合更染料熒光顯微鏡下呈亮綠色可在熒光微鏡下快速方便的檢出，適用于多數(shù)品系。三．實(shí)材料及設(shè)備1/7

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各,3M9培NGM培養(yǎng)基普載暗吸熒四．實(shí)方法及步驟1.蟲接種、同步2.取樣：在12孔板培養(yǎng)板上每孔吸取900μL預(yù)先接入少量OP50的培養(yǎng)基，每孔鉑金絲挑取培養(yǎng)20~30條成體線蟲3.染色：向N2與ced-3品系每孔加入啶橙100μL,混勻后置于培養(yǎng)箱（光）染色。4.方法對(duì)照組觀察：向ced-1::GFP系中加入1鹽酸左旋咪唑，麻痹線蟲后在熒光顯鏡下觀察。2/7

四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)告5.恢復(fù)已染色的線蟲吸出于35mm培基中恢復(fù)45~60min，使攝入的含染料的OP50排出蟲并置于熒光顯微鏡下觀察6.觀察述三品系用相同方法觀察激發(fā)鏡中，凋亡細(xì)胞位于生殖腺?gòu)澽D(zhuǎn)彎附近亮黃染色時(shí)間長(zhǎng)亮橙色（染色時(shí)間短核為均勻的暗綠色。五．實(shí)結(jié)果（一）對(duì)組：

組凋色凋亡細(xì)胞圖方法對(duì)組熒光顯鏡觀察結(jié)在方法對(duì)照組中可觀察到GFP蛋白標(biāo)記的凋亡細(xì)胞的陽(yáng)性結(jié)果生殖腺臂彎轉(zhuǎn)彎附近有亮綠色的空泡，外沿顏色最深內(nèi)側(cè)顏色淺該品系無(wú)需染色發(fā)出綠3/7

四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)告色熒光的是標(biāo)記蛋白GFP白聚集在凋亡細(xì)胞細(xì)胞膜上。（二）組圖實(shí)驗(yàn)組光顯微鏡察結(jié)果在實(shí)驗(yàn)組中能觀察到吖啶橙標(biāo)記的凋亡細(xì)胞的陽(yáng)性結(jié)果：呈現(xiàn)亮橙色的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在20物鏡中，凋亡細(xì)胞位于生殖腺臂彎轉(zhuǎn)彎附近呈亮黃（染色時(shí)間長(zhǎng)）或亮橙色（染色時(shí)間短未凋亡細(xì)胞核為均勻的暗綠色。（三）對(duì)組：4/7

四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)告圖陰性對(duì)組熒光顯鏡觀察結(jié)由于凋亡基因缺陷品系以在陰性對(duì)照組中理論上不可能觀察到凋亡細(xì)胞的陽(yáng)性結(jié)果是在結(jié)果中仍然可以看到呈現(xiàn)亮橙色的細(xì)胞結(jié)構(gòu)兩種可能受損死亡的細(xì)胞染色時(shí)間過長(zhǎng)啶橙殺死細(xì)胞，產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。六．實(shí)討論1.實(shí)結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)使用吖啶橙或GFP蛋白標(biāo)記凋亡細(xì)胞其在熒光顯微鏡下顯示為亮綠色2.討一：實(shí)中有哪注意事？5/7

四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)告1.吖啶橙有較強(qiáng)毒性長(zhǎng)時(shí)間使用吖啶橙染色會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡染色超過90min增假陽(yáng)性。2.吖啶橙有毒性，實(shí)過程中嚴(yán)禁直接接觸皮膚，取用吖啶橙要在實(shí)驗(yàn)室專門的區(qū)，所有接觸了吖啶橙的實(shí)驗(yàn)器械都要集中處理。3.在取用線蟲時(shí)，動(dòng)要輕緩，防止傷害線蟲，如果確實(shí)感覺度太大，可以向培養(yǎng)中加入少量無(wú)菌水或培養(yǎng)基，然后用吸管吸取含有線蟲的液以吸取線蟲。3.討二：如設(shè)置陽(yáng)對(duì)照？答：線蟲研究的常用系還包括與ced-5這兩個(gè)品系特點(diǎn)是此果用這兩個(gè)品系作為陽(yáng)性對(duì)照以很容易在熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞。4.討三：ced-1::GFP組的作用什么？答：該組為方法對(duì)照作用是證明本次實(shí)驗(yàn)所用的吖啶橙標(biāo)記亡細(xì)胞的方法準(zhǔn)確可跨膜蛋白在啟動(dòng)子作下，在鞘細(xì)胞表達(dá)，凋亡過程中，CED-1::GFP蛋白簇聚于凋細(xì)胞周圍，不需要染，但用于其它品系需要進(jìn)行遺傳操作