熒光分析技術(shù)第二章熒光信號機制演示文稿

第二章熒光信號機制2.1熒光探針2.2熒光信號機制目前一頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點2.1熒光探針(Fluorescentprobe)定義：建立在光譜化學(xué)和化學(xué)波導(dǎo)與量測技術(shù)基礎(chǔ)上的將分析對象的化學(xué)信息以熒光信號表達的傳感裝置。信號表達包括熒光的增強或減弱、光譜的移動、熒光壽命的變化等。圖1，熒光探針的結(jié)構(gòu)報告基團Fluorophore連接基團Spacer識別基團Receptor構(gòu)成：1．識別結(jié)合基團(R)，能選擇性地與被分析物結(jié)合，并使傳感器所處的化學(xué)環(huán)境發(fā)生改變。2．信號報告基團(F)，把識別基團與被分析物結(jié)合引起的化學(xué)環(huán)境變化轉(zhuǎn)變?yōu)槿菀子^察到的輸出信號。3．連接基團(S)，將信號報告基團和識別結(jié)合基團連接起來。目前二頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點分類：1，按發(fā)光材料類型：小分子有機熒光探針（Chemosensor）、生物熒光探針（Biosensor）和納米熒光探針（Nanosensor）；ChemosensorBiosensorNanosensor目前三頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點2，按發(fā)射信號類型：增強/淬滅型（Turn-on/off）和比率型（Ratiometric）熒光探針；Turn-onfluorescentprobeRatiometricfluorescentprobe目前四頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點3，按發(fā)射波長類型：可見光（Visiblelight）和近紅外（Near-infrared）熒光探針；Visiblelightprobe(350-650nm)Near-infraredprobe(650-900nm)目前五頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點4，按激發(fā)光類型：單光子（One-photon）、雙光子（Two-photon）和上轉(zhuǎn)換熒光探針。One-photonprobeTwo-photonprobe目前六頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點熒光探針的優(yōu)點：靈敏度高檢測限低至納摩爾級別選擇性好對特定分析物有響應(yīng)響應(yīng)時間短使用方便、成本低熒光光譜儀、便攜式三用紫外儀實時監(jiān)測檢測不同時段的信號變化原位檢測精準檢測可視化檢測肉眼觀察或熒光信號具體化非破壞性檢測保持生物樣本的完整性由于具有上述優(yōu)點，使得熒光探針在多個領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，特別是在分子生物學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)等。目前七頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點2.2熒光分子探針的設(shè)計原理

熒光分子探針的設(shè)計原理主要有以下幾種：鍵合法、置換法和化學(xué)計量計法。1、鍵合法：是指將探針中的識別基團和熒光基團通過共價鍵連接起來設(shè)計熒光探針的方法。Reversible目前八頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點當識別基團與被分析物結(jié)合時會引起熒光基團的化學(xué)環(huán)境發(fā)生變化，通過顏色的改變、光譜的移動、熒光強度的增減等現(xiàn)象來表現(xiàn)，這些變化可被裸眼或者儀器識別。這是目前在設(shè)計金屬離子熒光探針中應(yīng)用最廣泛的方法。Zn2+fluorescentprobe受體分子的識別基團：受體分子的識別基團設(shè)計以軟硬酸堿理論、配位作用以及超分子作用力（如氫鍵、范德華力等）作為理論指導(dǎo)，多選擇含氮、硫、磷雜環(huán)化合物作為識別分子。目前九頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點2、置換法：是利用識別基團分別與熒光基團和被分析物結(jié)合能力的不同來實現(xiàn)對被分析物的檢測。Reversible識別基團和熒光基團形成絡(luò)合物，當被分析物加入到該體系中時，由于識別基團與被分析物的結(jié)合能力要強于識別基團與熒光基團的結(jié)合能力，因此被測物將熒光基團置換出來，從而引起了整個體系熒光等化學(xué)參數(shù)的變化，進而為儀器或者裸眼識別，該原理常用于設(shè)計陰離子熒光探針。目前十頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點Cu2+S2-Cu2+-S2-fluorescentprobe目前十一頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點3、化學(xué)計量計法:是利用探針分子與識別客體之間特異不可逆的化學(xué)反應(yīng)前后產(chǎn)生熒光信號的不同而對分析對象進行檢測的一類探針。主要包括兩種類型：一類是目標分子和探針分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)后通過共價鍵相連接；另一類是目標離子催化了一個化學(xué)反應(yīng)。第一類：Cys

fluorescentprobe目前十二頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點第二類：+特點和優(yōu)點：基于化學(xué)計量計原理設(shè)計的熒光分子探針通常具有不可逆性、和較好的選擇性和靈敏度。目前十三頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點2.2熒光信號機制(Fluorescencesignalmechanisms)1、光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移PET2、分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移ICT3、熒光共振能量轉(zhuǎn)移FRET4、共價鍵能量轉(zhuǎn)移TBET5、聚集誘導(dǎo)發(fā)光AIE6、激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移ESIPT7、扭曲分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移TICT8、單體/激基締合物M/E用于解釋熒光探針與分析物作用前后熒光信號變化現(xiàn)象，主要包括：目前十四頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點1,光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET,Photoinduced

ElectronTransfer)光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移是指電子給體或電子受體受光激發(fā)后，激發(fā)態(tài)的電子給體與電子受體之間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移的過程。識別基團與被分析物結(jié)合之前，熒光基團受激發(fā)，最終被光激發(fā)到激發(fā)態(tài)的電子不能躍遷到基態(tài)，使得熒光基團的熒光淬滅。而識別基團與被分析物結(jié)合后，PET過程受阻，熒光基團的熒光得以恢復(fù)。PET熒光信號機制示意圖PET熒光探針光譜變化的特點：只有熒光強度的變化，沒有波長的移動。目前十五頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點

PET過程可以用前線軌道理論具體解釋：若識別基團的HOMO或LOMO軌道介于熒光團兩軌道能量之間，此時就可以發(fā)生識別基團與熒光團之間的電子轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致熒光的猝滅；當識別基團與分析物結(jié)合后，HOMO軌道能量降低或LUMO軌道能量升高，使PET受阻，激發(fā)態(tài)電子可以返回基態(tài)，熒光恢復(fù)。根據(jù)熒光團得失電子情況，分為a-PET（還原型）和d-PET（氧化型）兩種類型。前線軌道解釋a-PET熒光信號機制示意圖ehυeNohυ目前十六頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點Cu+Cu+a-PET基于a-PET機理的Cu+熒光探針目前十七頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點基于a-PET機理的Ag+熒光探針目前十八頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點a-PETa-PET基于a-PET機理的PO43-熒光探針基于a-PET熒光機制探針的識別基團的特征？主要由雜原子（O,N,S）組成的配體，易與金屬離子配位或者與陰離子形成氫鍵。目前十九頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點前線軌道解釋d-PET熒光信號機制示意圖eNohυehυ通常帶哪些官能團的識別基團適用于設(shè)計基于d-PET熒光機制的探針？LUMO軌道能量較低官能團，比如硝基(-NO2),α不飽和羰基等。目前二十頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點BD-ssLPS+BD-ss基于d-PET機理的H2S2熒光探針目前二十一頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點基于d-PET機理的H2S熒光探針目前二十二頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點d-PET基于d-PET機理的Cys熒光探針目前二十三頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點2,分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT,IntramolecularChargeTransfer)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移是指分子在激發(fā)態(tài)時發(fā)生分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移，造成正負電荷分離，形成分子電荷轉(zhuǎn)移態(tài)。分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移熒光探針分子通常是熒光團上同時連有供電子基團(電子給體，Donor)和吸電子基團(電子受體，Acceptor),通過π鍵提供電子轉(zhuǎn)移的通道，形成強的推-拉作用的共軛體系，其吸電子基團或推電子基團本身充當識別基團的一部分。

當識別基團和被分析物結(jié)合后，作為識別基團的供電子部分或拉電子部分的推拉電能力發(fā)生的改變，整個體系的的π電子結(jié)構(gòu)重新分布，熒光團的推-拉作用被抑制或強化，從而導(dǎo)致吸收光譜、發(fā)射光譜發(fā)生變化，主要是光譜紅移或藍移。目前二十四頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點情況一：供電子基團和分析物結(jié)合，會減弱其推供電子的能力，使得整個體系電荷分離程度減弱了，導(dǎo)致熒光光譜和吸收光譜藍移(Blueshift)。光譜藍移熒光淬滅OR分析物與供電子作用的ICT熒光機制示意圖目前二十五頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點情況二：拉電子基團和分析物結(jié)合，會增強其拉供電子的能力，使得整個體系電荷分離程度增強了，導(dǎo)致熒光光譜和吸收光譜紅移(Redshift)。光譜紅移分析物與拉電子作用的ICT熒光機制示意圖以上情況主要是針對金屬離子探針。若拉電子基團與分析物作用之后拉電子能力減弱，會導(dǎo)致光譜藍移。目前二十六頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點基于ICT機理的Zn2+熒光探針實例：ICT配位型金屬離子熒光探針目前二十七頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點基于ICT機理的Zn2+熒光探針基于PET機理的Zn2+熒光探針基于PET和ICT熒光機制配位型金屬離子探針的識別基團的差別？前者以非共軛鍵連接熒光團，后者直接連接在熒光團上。目前二十八頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點基于ICT機理的Zn2+熒光探針目前二十九頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點化學(xué)反應(yīng)型ICT熒光探針基于ICT機理的ClO-熒光探針基于ICT機理的甲醛熒光探針目前三十頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點基于ICT機理的ClO-熒光探針目前三十一頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點基于ICT機理的Pd0熒光探針目前三十二頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點基于ICT機理的GSH熒光探針基于ICT機理的GSH熒光探針目前三十三頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點常見用于設(shè)計ICT機制熒光探針的熒光染料有哪些？具有強推拉體系的熒光團，比如香豆素、萘、萘酰亞胺、苯并惡二唑、菲咪唑等。目前三十四頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點3,熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET,FluorescenceResonanceEnergyTransfer)熒光共振能量轉(zhuǎn)移指一個熒光體系含有兩個熒光團，一個充當能量供體(Donor,D)，另一個為能量受體(Acceptor,A)，當用供體D的激發(fā)去激發(fā)熒光體系時，可以發(fā)生從D到A的非輻射能量轉(zhuǎn)移，從而發(fā)射出受體A熒光團的熒光。FRET發(fā)生所具備的條件：（1）能量供體熒光團D的熒光發(fā)射位于短波長處，且發(fā)射光譜和能量受體熒光團A的吸收光譜有一定重疊，能量受體能夠在能量供體的發(fā)射波長處吸收能量；（2）能量供體與能量受體相隔的距離為10-100?。能量傳遞效率：E=[(Fdonor

?Fdonorincassette)/Fdonor]×100%FRET熒光機制示意圖（3）供體和受體能量轉(zhuǎn)移偶極子的方向必須近似地平行。目前三十五頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點設(shè)計FRET熒光探針的策略：（1）通過調(diào)節(jié)能量受體A的摩爾吸光系數(shù)來改變其吸收光譜與能量供體發(fā)射光譜的重疊效率，以達到調(diào)控FRET；（2）通過調(diào)節(jié)能量受體A與能量供體D之間的距離來調(diào)控FRET；（3）通過調(diào)節(jié)能量受體A的吸收波長來改變其吸收光譜與能量供體發(fā)射光譜的重疊效率，以達到調(diào)控FRET；目前三十六頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點策略一：基于Coumarin-Rhodamine的FRET熒光探針第一代：基于FRET機理的Hg2+熒光探針目前三十七頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點第二代：基于FRET機理的Cu2+熒光探針目前三十八頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點第三代：基于FRET機理的Cu2+熒光探針目前三十九頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點目前四十頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點基于其他以Rhodamine為能量受體的FRET熒光探針基于FITC-Rho平臺的FRETpH探針基于Nap-Rho平臺的FRETpH探針目前四十一頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點基于BOD-Rho平臺的FRETAu3+探針基于DNS-Rho平臺的FRETAu3+探針基于NT-Rho平臺的FRETAu3+探針基于QNL-Rho平臺的FRETAu3+探針目前四十二頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點以Fluorescein為能量受體的FRET熒光探針H2O2基于Cou-FITC平臺的FRETH2O2探針基于BOD-FITC平臺的FRETCys探針目前四十三頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點策略二：通過調(diào)節(jié)A-D距離的FRET熒光探針目前四十四頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點策略三：通過調(diào)節(jié)吸收波長的FRET熒光探針基于Cou-Nap平臺的FRETH2S探針目前四十五頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點基于Cou-SBD平臺的FRETCys探針目前四十六頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點基于FRET的熒光探針的特征？1，具有雙熒光團；2，單激發(fā)波長和雙發(fā)射帶的比率信號；3，pseudo-Stokesshift較大。有哪些熒光團常用來設(shè)計FRET熒光探針的能量供體、受體？目前四十七頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點特殊情況：增強型FRET熒光探針！Turn-onFRET-basedCys探針當能量受體是一個無熒光的基團（Quencher）時，供體能量熒光被淬滅，探針無熒光；當能量受體被破壞/移除后，探針熒光恢復(fù)。目前四十八頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點4,共價鍵能量轉(zhuǎn)移(TBET,Through-BondEnergyTransfer)TBET能量體系與FRET能量體系不同，不要求能量供體的發(fā)射光譜與能量受體的吸收光譜有一定程度的重疊，它是能量供體與能量受體經(jīng)過共軛鍵連接，將供體能量通過鍵直接傳遞到受體，但是能量供體與受體不共平面。在熒光光譜中體現(xiàn)為，激發(fā)能量供體，顯示能量受體熒光發(fā)射峰。

FRET和TBET熒光機制示意圖TBET相比較于FRET的優(yōu)勢？1，能量供/受體的發(fā)射/吸收光譜無重疊要求；2，能量傳遞效率高。目前四十九頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點TBET-basedpH探針TBET-basedHg2+探針目前五十頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點FRET-basedCu2+探針目前五十一頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點5,聚集誘導(dǎo)發(fā)光(AIE,Aggregation-inducedEmission)傳統(tǒng)的熒光生色團在高濃度下熒光會減弱甚至不發(fā)光，這種現(xiàn)象被稱作“濃度猝滅”效應(yīng)，通常也被叫做聚集導(dǎo)致猝滅(ACQ,aggregation-causedquenching)。聚集誘導(dǎo)發(fā)光是指一類非平面的分子在其良溶液中不發(fā)光或發(fā)光微弱，而聚集后或固態(tài)下熒光顯著增強的現(xiàn)象。2001年由堂本忠團隊發(fā)現(xiàn)理論依據(jù)：分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)受限(restrictionofintramolecularrotations,RIR)。分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)導(dǎo)致激發(fā)態(tài)能量以非輻射形式衰減，熒光淬滅；而旋轉(zhuǎn)受阻時，激發(fā)態(tài)能量以輻射形式衰減，發(fā)射強熒光。AIE機理示意圖（六苯基噻咯）目前五十二頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點ExcitedstateenergyGroundstateenergyNonradiativetransitionproccessRadiativetransitionprocess目前五十三頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點

SortingoffluorescenceIntensity?WeakStrongAIE發(fā)光材料相比較ACQ材料的優(yōu)點：2，AIE材料在生物成像應(yīng)用中可用較高的濃度，增加了其檢測靈敏度（腫瘤成像）；1，AIE材料在固態(tài)下依然能發(fā)強光，可用于設(shè)計光學(xué)器件（半導(dǎo)體發(fā)光材料、可折疊顯示器和風(fēng)洞試驗）；典型的AIE有機熒光染料：四苯乙烯（TPE）六苯基噻咯（HPS）二苯乙烯基蒽（DSA）目前五十四頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點目前五十五頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點目前五十六頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點目前五十七頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點6,激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(ESIPT,Excited-StateIntramolecularProtonTransfer)

含有分子內(nèi)氫鍵的分子，光激發(fā)時其質(zhì)子酸性提高，易于發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移，可發(fā)生分子內(nèi)激發(fā)態(tài)質(zhì)子轉(zhuǎn)移的物質(zhì)一般含質(zhì)子供體(羥基或氨基)和質(zhì)子受體(亞胺鍵或羰基)。受光激發(fā)時，質(zhì)子從羥基或氨基轉(zhuǎn)移至鄰近的與之形成氫鍵的原子上（一般能形成五元環(huán)或六元環(huán)，距離不超過2?,t=10-12S），由之前的醇式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成酮式結(jié)構(gòu)。由于光激發(fā)所形成的酮式異構(gòu)體在激發(fā)態(tài)時（而不是基態(tài)）較原醇式結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，故光異構(gòu)體的熒光較原分子的熒光位于長波長處。ESIPT態(tài)能量降低,光譜紅移目前五十八頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點目前五十九頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點目前六十頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點目前六十一頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點7,扭曲分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(TICT,TwistedIntramolccularChargeTransfer)

在熒光壽命期間，與發(fā)色團單鍵相連的助色團(通常是與發(fā)色團相連的氨基)會發(fā)生分子內(nèi)的扭轉(zhuǎn)，使得構(gòu)像發(fā)生了變化；另有一種是以雙鍵相連的，旋轉(zhuǎn)后構(gòu)型發(fā)生了變化。旋轉(zhuǎn)的動力來源于電子激發(fā)后受體(acceptor)的吸電性，扭轉(zhuǎn)后的電子云分布將更加有利于系統(tǒng)的穩(wěn)定，這種扭轉(zhuǎn)將有利于電荷的完全分離。所形成的激發(fā)態(tài)稱為TICT態(tài)，是完全的電荷分離。TICT態(tài)能量降低,光譜紅移；但由于扭轉(zhuǎn)導(dǎo)致非輻射躍遷損失能量，熒光信號變化模式通常為Turn-on/offTICT熒光機制示意圖目前六十二頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點目前六十三頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點目前六十四頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點8,單體/激基締合物(M/E,Monomer/Excimer)如果兩個相同的熒光團(主要是多環(huán)芳烴)之間的距離和位置合適，當其中一個熒光團被激發(fā)以后就會和另外一個處于基態(tài)的熒光團通過π-π堆積作用形成激基締合物(excimer)，其熒光發(fā)射光譜的特征表現(xiàn)是原來單體的發(fā)射峰減弱或者消失，取而代之的是一個新的、強而寬的、長波長的無振動精細結(jié)構(gòu)發(fā)射峰。由于形成這種激基締合物需要激發(fā)態(tài)分子與基態(tài)分子達到“碰撞”距離約3.5?,因此熒光團間的距離是激基締合物形成和破壞的關(guān)鍵。由于萘、芘、葸等熒光團具有較長的激發(fā)單線態(tài)壽命，易形成激基締合物等特點，因此常常被用于此類探針中。M/E熒光機制示意圖目前六十五頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點目前六十六頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點目前六十七頁\總數(shù)六十九頁\編于二十三點