細(xì)胞生物學(xué)課件：第十六章 PCD與細(xì)胞

第十三章PCD與細(xì)胞衰老機(jī)體結(jié)構(gòu)細(xì)胞增殖細(xì)胞分化細(xì)胞凋亡細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)染色體（DNA與蛋白質(zhì)的相互作用）衰老Sculptingthedigitsinthedevelopingmousepawbyapoptosis（Wood2000）程序性細(xì)胞死亡細(xì)胞衰老PRIZEDHorvitz,andSulstonsharePhysiologyorMedicineNobel（2002）

“fortheirdiscoveriesconcerninggeneticregulationoforgandevelopmentandprogrammedcelldeath”1090–131=959(cells)第一節(jié)程序性細(xì)胞死亡對(duì)單細(xì)胞生物來(lái)說(shuō)，細(xì)胞的死亡即為個(gè)體的死亡。對(duì)多細(xì)胞生物來(lái)講，細(xì)胞的死亡對(duì)于維持個(gè)體的更深生長(zhǎng)發(fā)育及其生命活動(dòng)是必需的?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，不論是單細(xì)胞生物還是多細(xì)胞生物，其細(xì)胞死亡都會(huì)受受到細(xì)胞內(nèi)某種由遺傳機(jī)制決定的“死亡程序”控制，也即“程序性細(xì)胞死亡”（Programmedcelldeath,PCD).一.細(xì)胞凋亡的研究歷史

1.

凋亡概念的形成和形態(tài)學(xué)的研究(1972）1972年Kerr等在英國(guó)癌癥雜志發(fā)表論文，首次提出細(xì)胞凋亡(apotosis)的概念。宣告了對(duì)細(xì)胞凋亡的真正探索的開(kāi)始。2．DNA的降解和內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的參與。(1987）3.蛋白質(zhì)水解酶活化的研究(1995)4.細(xì)胞膜的變化(1997)5.線粒體的變化和分子生物學(xué)的研究(1998-)1)相關(guān)基因及調(diào)控2）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)3）各種分子及其相互作用及相互關(guān)系4）疾病機(jī)制的闡明，以及新療法的探索及問(wèn)世。

二.概念

細(xì)胞凋亡是在體內(nèi)外因素誘導(dǎo)下，由基因嚴(yán)格控制而發(fā)生的自主性細(xì)胞有序死亡。細(xì)胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）

PCD最初是1956年發(fā)育生物學(xué)中提出的概念，是個(gè)功能性概念，強(qiáng)調(diào)的是其分子生物學(xué)和生理功能，一般指生理性細(xì)胞死亡。描述在一個(gè)多細(xì)胞生物體中某些細(xì)胞死亡是個(gè)體發(fā)育中的一個(gè)預(yù)定的，并受到嚴(yán)格程序控制的正常組成部分。細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別

細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的區(qū)別特征細(xì)胞凋亡細(xì)胞壞死誘導(dǎo)因素生理及弱刺激強(qiáng)烈刺激受累范圍單個(gè)細(xì)胞丟失成群細(xì)胞死亡膜完整性保持到晚期早期即喪失細(xì)胞體積減少、固縮增大腫脹染色質(zhì)凝聚成半月形稀疏成網(wǎng)狀細(xì)胞器無(wú)明顯變化腫張破壞溶酶體保持完整破壞外溢細(xì)胞形狀形成凋亡小體破裂成碎片基因組DNA有控降解隨機(jī)降解大分子合成一般需要不需要基因調(diào)控有無(wú)后果不引起炎癥反應(yīng)引起炎癥反應(yīng)意義生理死亡方式病理死亡方式/三.細(xì)胞凋亡的生物學(xué)特征形態(tài)學(xué)變化生物化學(xué)變化

DNA片段化大分子的合成

tTG（組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶）的積累并達(dá)到較高的水平。

細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征（1）凋亡的起始：微絨毛的消失，細(xì)胞間接觸的消失，與周?chē)募?xì)胞脫離；細(xì)胞質(zhì)中，線粒體大體完整，染色質(zhì)固縮；細(xì)胞質(zhì)密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細(xì)胞色素C到胞漿，膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面（2）凋亡小體的形成。核膜核仁破碎，核染色質(zhì)斷裂為大小不等的片段，與某些細(xì)胞器如線粒體一起聚集，為反折的細(xì)胞膜所包圍（3）凋亡小體逐漸被周?chē)鷮?zhuān)職或非專(zhuān)職吞噬細(xì)胞吞噬胸腺細(xì)胞正常凋亡

細(xì)胞凋亡DNA的片段化四.細(xì)胞凋亡的過(guò)程及機(jī)理

接受凋亡信號(hào)凋亡調(diào)控分子間的相互作用蛋白水解酶（caspases）的活化凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)細(xì)胞凋亡的兩條通路：膜受體通路、線粒體通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子◆物理性因子，包括射線（紫外線，

射線等），較溫和的溫度刺激（如熱激，冷激）等◆化學(xué)及生物因子：包括活性氧基團(tuán)和分子，DNA和蛋白質(zhì)合成的抑制劑，激素，細(xì)胞生長(zhǎng)因子，腫瘤壞死因子（TNF），抗Fas/Apo-1/CD95抗體等細(xì)胞凋亡的分子調(diào)控機(jī)理

●線蟲(chóng)(C.elegans)凋亡研究發(fā)現(xiàn)ced3,ced4基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制細(xì)胞凋亡。Ced3哺乳類(lèi)同源物是ICE(Interleukin-1-convertingenzyme)，即Caspase1 ●Caspase家族與凋亡

●Bcl-2家族、線粒體與細(xì)胞凋亡●細(xì)胞凋亡的分子機(jī)理（1）．Caspase家族相當(dāng)于線蟲(chóng)的ced-3，是引起凋亡的關(guān)鍵酶。特點(diǎn)：①酶活性依賴(lài)于cys殘基的親核性；②總是在asp之后切斷底物，故名caspase（cysteine

aspartate-specificprotease）。③亞基由同一基因編碼，前體被切割后產(chǎn)生兩個(gè)活性亞基，組成異四聚體。Caspaseclassification（Zimmermann2001）ExecutioneroreffectorAutocatalyticinitiatorCaspase活化

Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活依賴(lài)于其他的Caspase在它的天冬氨酸位點(diǎn)裂解活化或自身活化胱冬肽酶在細(xì)胞凋亡中的作用：滅活細(xì)胞凋亡發(fā)生的抑制劑直接破壞裂解細(xì)胞結(jié)構(gòu)裂解某些功能性的酶蛋白Caspase作用底物（2）.細(xì)胞凋亡的兩種基本途徑死亡信號(hào)途徑線粒體途徑2．Apaf-1凋亡酶激活因子-1（apoptoticproteaseactivatingfactor-1），線蟲(chóng)的同源物為ced-4。作用：參與線粒體凋亡途徑，該基因敲除后，小鼠神經(jīng)細(xì)胞過(guò)多，腦畸形發(fā)育。Apaf-1與cytc、ATP/dATP結(jié)合后，召集caspase-9，形成凋亡體（apoptosome），激活caspase-3，啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)。3.Bcl-2基因家族含有1-4個(gè)Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域（BH1-4）。分兩類(lèi)：抗凋亡基因，如：Bcl-2；促凋亡基因，如：Bax。促凋亡蛋白能引起線粒體外膜通透性改變，導(dǎo)致cytc釋放，引起凋亡。Bcl-2相當(dāng)于線蟲(chóng)的ced9。主要定位于線粒體膜、也存在于ER和外核膜，拮抗促凋亡蛋白的功能。Bcl-2genefamily（Zimmermann2001）4.Fas

fas又稱(chēng)作APO-1，屬TNF受體家族。1993年人白細(xì)胞分型國(guó)際會(huì)議統(tǒng)一命名為CD95。fas基因編碼產(chǎn)物為分子量45KD的跨膜蛋白。Fas蛋白與Fas配體組成Fas系統(tǒng)，二者的結(jié)合激活caspase。Fas誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡Fas與配體結(jié)合發(fā)生三聚化，通過(guò)胞內(nèi)的DD區(qū)（Deathdomain）與接頭蛋白FADD的DD區(qū)結(jié)合。FADDN端通過(guò)DED區(qū)（deatheffectordomain）與Caspase-8前體結(jié)合，Caspase-8通過(guò)自身剪接激活。5．P53基因組的守護(hù)者。輻射誘導(dǎo)的DNA損傷可通過(guò)ATM激活p53，阻斷細(xì)胞周期，并提高Fas的表達(dá)，誘導(dǎo)凋亡。6．Myc轉(zhuǎn)錄因子，生長(zhǎng)因子存在，Bcl-2基因表達(dá)時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞增殖，反之引起細(xì)胞凋亡。7.ATM是DNA損傷檢驗(yàn)的重要蛋白激酶，能激活P53。七.細(xì)胞凋亡的生物學(xué)意義

生長(zhǎng)發(fā)育：組織與器官的塑造（趾的分化）；動(dòng)物變態(tài)；皮膚角質(zhì)形成；免疫細(xì)胞分化：克隆選擇；防御：清除衰老細(xì)胞、DNA損傷的細(xì)胞、以及被病原體感染的細(xì)胞。免疫細(xì)胞凋亡胸腺細(xì)胞成熟過(guò)程中的凋亡陽(yáng)性選擇陰性選擇激活誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡：（activation-inducedcelldeath，AICD）

CTL誘導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡：穿孔素介導(dǎo)的靶細(xì)胞死亡

Fas介導(dǎo)的靶細(xì)胞凋亡B細(xì)胞凋亡:經(jīng)過(guò)基因重排,92%的細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡與人類(lèi)疾病細(xì)胞凋亡受抑制有關(guān)的疾病

惡性腫瘤:濾泡性淋巴瘤、乳腺癌、等白血病自身免疫性疾病：系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎炎病毒感染性疾?。合俨《静?、庖疹病毒病細(xì)胞凋亡增多有關(guān)的疾病

艾滋?。荷窠?jīng)變性性疾?。涸缋闲赃t呆、帕金森病、小腦退化病骨髓發(fā)育不全性疾病

缺血性疾病

酒精中毒性肝炎PCD在植物體整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中普遍存在。植物體在胚胎發(fā)育、根、莖、葉、花等器官的形態(tài)建成、細(xì)胞增殖分化過(guò)程中,都伴隨有PCD的發(fā)生。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)中的PCD現(xiàn)象糊粉層細(xì)胞的退化消失

根冠細(xì)胞的死亡

導(dǎo)管分子的形成

葉片的形成與衰老

生殖生長(zhǎng)中的PCD現(xiàn)象大小孢子的形成與發(fā)育

雌、雄配子體的發(fā)育

胚的發(fā)育

單性花的形成八.細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法.一、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè).二、磷脂酰絲氨酸外翻分析（AnnexinV法）三、線粒體膜勢(shì)能（mt）的檢測(cè)四、DNA片斷化檢測(cè)

五、TUNEL法六、Caspase-3活性的檢測(cè)

七、WB檢測(cè)八、凋亡相關(guān)蛋白TFAR19的表達(dá)和細(xì)胞定位分析

細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)

1光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡

未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見(jiàn)凋亡小體。染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色、蘇木精染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，呈新月?tīng)罡皆诤四ぶ車(chē)?熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變來(lái)評(píng)判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。常用的DNA特異性染料有：HO,Hoechst33342;HO,Hoechst33258;DAPI。NuclearmorphologicalchangesofHeLacellsinapoptosisprocess

（488nm400）電鏡觀察凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤(pán)繞，出現(xiàn)許多稱(chēng)為氣穴現(xiàn)象的空泡結(jié)構(gòu)。細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。

線粒體膜勢(shì)能（mt）的檢測(cè)

線粒體熒光染料：Rhodamine123、DiOC6（3）、JC-1、TMRM等對(duì)線粒體膜電位非常敏感，其熒光的增強(qiáng)或減弱說(shuō)明線粒體內(nèi)膜電負(fù)性的增高或降低。DNA片段化分析

細(xì)胞凋亡時(shí)主要生物化學(xué)特征是其染色質(zhì)發(fā)生濃縮,染色質(zhì)DNA在核小體單位之間的連接處斷裂,形成180200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段,在凝膠電泳上表現(xiàn)為梯形電泳圖譜(DNAladder)。第二節(jié)細(xì)胞的衰老又稱(chēng)老化，指細(xì)胞隨著年齡的增加，機(jī)能和結(jié)構(gòu)發(fā)生退行性變化，趨向死亡的不可逆的現(xiàn)象。衰老和死亡是生命的基本現(xiàn)象，衰老過(guò)程發(fā)生在生物界的整體水平、種群水平、個(gè)體水平、細(xì)胞水平以及分子水平等不同的層次。Hayflick界限(HayflickLimitation）概念：關(guān)于細(xì)胞增殖能力和壽命是有限的觀點(diǎn)細(xì)胞，至少是培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞，不是不死的，而是有一定的壽命；它們的增殖能力不是無(wú)限的，而是有一定的界限，這就是Hayflick界限。癌細(xì)胞或培養(yǎng)的細(xì)胞系是不正常細(xì)胞，其染色體數(shù)目或形態(tài)已經(jīng)不同于原先的細(xì)胞細(xì)胞的增殖能力與供體年齡有關(guān)物種壽命與培養(yǎng)細(xì)胞壽命之間存在著一定的關(guān)系二倍體細(xì)胞的衰老是由細(xì)胞本身決定的

◆決定細(xì)胞衰老的因素在細(xì)胞內(nèi)部，不是外部的環(huán)境

◆是細(xì)胞核而不是細(xì)胞質(zhì)決定了細(xì)胞衰老細(xì)胞來(lái)源人胚肺成纖維細(xì)胞中年人成纖維細(xì)胞老年人成纖維細(xì)胞可增殖代數(shù)40-60202-4不同年齡來(lái)源的人成纖維細(xì)胞的增殖代數(shù)二、細(xì)胞在體內(nèi)條件下的衰老●在機(jī)體內(nèi)，細(xì)胞的衰老和死亡是常見(jiàn)的現(xiàn)象，甚至在個(gè)體發(fā)育的早期也會(huì)發(fā)生;●正常情況下終生保持分裂的細(xì)胞，其分裂能力是否隨著有機(jī)體年齡的增高而下降？它們會(huì)不會(huì)衰老？

◆衰老動(dòng)物體內(nèi)，細(xì)胞分裂速度顯著減慢，其原因主要是G1期明顯延長(zhǎng);◆衰老個(gè)體內(nèi)的環(huán)境因素影響了細(xì)胞的增殖和衰老; ◆骨髓干細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)說(shuō)明隨著年齡的增加，干細(xì)胞增殖速度也趨緩慢.一、細(xì)胞衰老的特征

（一）形態(tài)變化1.水分減少、體積改變2.生化代謝與化學(xué)組成的改變蛋白質(zhì)合成速度下降，酶含量減少或功能降低。3.代謝廢物——脂褐素的堆積脂褐素的堆積嚴(yán)重影響細(xì)胞的代謝活動(dòng)。1.

DNA：復(fù)制與轉(zhuǎn)錄受阻，端粒DNA、mtDNA缺失。DNA氧化、斷裂、缺失和交聯(lián)，甲基化程度降低。2.

RNA：