親和色譜分離技術(shù)

生物技術(shù)及應(yīng)用專業(yè)教學(xué)資源庫4.5親和色譜分離技術(shù)4.色譜分離技術(shù)基本原理1親和色譜法的特點2親和層析介質(zhì)3影響親和作用的因素4親和色譜法的操作方法5親和色譜分離技術(shù)親和色譜法的應(yīng)用6親和色譜（affinitychromatography，AFC）利用固定相配基與生物大分子之間的特殊生物親和力的不同實現(xiàn)分離的方法。

親和色譜廣泛用于酶、抗體、核酸、激素等生物大分子以及細胞、細胞器、病毒等物質(zhì)的分離與純化。特別是對分離含量極少而又不穩(wěn)定的活性物質(zhì)最有效，經(jīng)一步親和色譜即可純化幾百至幾千倍。親和色譜分離技術(shù)親和色譜是應(yīng)用生物高分子物質(zhì)能與相應(yīng)專一配基分子可逆結(jié)合的原理，將配基通過共價鍵牢固地結(jié)合于固相載體上制得親和吸附系統(tǒng)。生物分子上具有特定構(gòu)象的結(jié)構(gòu)域與配體的相應(yīng)區(qū)域結(jié)合，具有高度的特異性和親和力?；驹碛H和色譜法的特點親和色譜法的優(yōu)點1.高選擇性，待分離物質(zhì)與配基專一性結(jié)合，分辨率高。2.具有濃縮作用，可純化幾千倍，適用于含量極少的活性物質(zhì)分離，回收率高。3.操作條件溫和，有效保持樣品原有的生物學(xué)活性，適用于不穩(wěn)定的活性物質(zhì)的分離。親和色譜法的特點親和色譜法的缺點1.普遍性、通用性不夠。2.費用高。載體應(yīng)具備的條件：1.載體必須具有較好的理化穩(wěn)定性和生物惰性，非專業(yè)吸附小。2.具有大量可供活化和配基結(jié)合的化學(xué)基團，以供與配基共價連接之用。3.載體必須具有高度的水不溶性和親水性。4.載體必須有稀松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使大分子能自由進入。5.載體要有良好的機械性能，顆粒均勻。親和層析介質(zhì)親和載體親和層析介質(zhì)由載體和配基組成親和載體常用的親和載體：主要有多孔玻璃載體、聚丙稀酰胺載體、纖維素載體、葡聚糖凝膠載體、瓊脂糖凝膠和交聯(lián)聚苯乙烯等。親和層析介質(zhì)配基應(yīng)具備的條件：1.必須具有適當?shù)幕瘜W(xué)基團以利于固定在載體上。2.配基的分子大小合適，以減小分離過程中的空間位阻效應(yīng)。3.配基與被分離物質(zhì)之間有足夠大的親和力，復(fù)合物能穩(wěn)定一定時間。4.配基與被分離物質(zhì)之間具有合適的特異性（專一性配基與特異性配基）。5.配基與待分離物之間的結(jié)合具有可逆性。親和層析介質(zhì)親和配基配基的分類：按照配基的特性可分為有機小分子類、生物大分子類和染料化合物三類。按照配基的選擇性，親和色譜為配基又可分為專一性配基（僅對某種生物物質(zhì)具有特別強的親和性）和基團特異性配基（對某類化學(xué)基團或某一類生物分子具有結(jié)合作用）兩類。親和層析介質(zhì)親和配基常用的親和配基：抗原抗體抗體與抗原之間具有高度特異性結(jié)合能力，因此可利用抗體或抗原為配基分離純化相應(yīng)的抗原或抗體，此種親和色譜法又稱免疫親和色譜。利用免疫親和色譜法，特別是以單抗為配基的免疫親和色譜法是高度純化蛋白質(zhì)類生物大分子的有效手段。親和層析介質(zhì)親和配基常用的親和配基：蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)G蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)G與抗體的結(jié)構(gòu)非常相似，可做為各種抗體的親和配基。蛋白質(zhì)A來源于金黃色葡萄球菌，蛋白質(zhì)G分離自G群鏈球菌，與許多動物的免疫球蛋白的Fc片段具有很強的親和結(jié)合作用。它們與抗體的結(jié)合并不影響抗體與抗原的結(jié)合，因此它們也可用于分離抗原-抗體的免疫復(fù)合體。蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)G與不同種屬來源的各種免疫球蛋白的親和性不一。親和層析介質(zhì)親和配基常用的親和配基：凝集素外源凝集素是一種天然蛋白質(zhì)，含有糖結(jié)合部位，與一些糖的殘基或鏈段具有高度親和力，可結(jié)合糖基。不同凝集素與糖結(jié)合的特異性不同。伴刀豆球蛋白A是常用的親和配基，可用作糖蛋白、多糖、糖脂、各種含糖配基的生物大分子物質(zhì)以及整個細胞、細胞表面受體蛋白和細胞膜片段的分離純化。親和層析介質(zhì)親和配基常用的親和配基：酶抑制劑蛋白酶均存在抑制其活性的物質(zhì)稱酶抑制劑。具有特殊的結(jié)構(gòu)，能夠與酶的活性中心結(jié)合，從而抑制酶的活性。酶的抑制劑可以作為配基用于酶的分離純化。親和層析介質(zhì)親和配基常用的親和配基：輔酶和磷酸腺苷某些酶需要在輔酶存在的情況下才能表現(xiàn)出催化活性，即輔酶能與脫氫酶和激酶之間通過親和作用相互結(jié)合，因此這些輔酶可用作脫氫酶和激酶的親和配基。主要的輔酶有NAD、NADP、ATP。親和層析介質(zhì)親和配基常用的親和配基：過度金屬離子銅、鎳、鋅等可與氮、硫、氧等供電原子產(chǎn)生配位鍵，因此可與蛋白質(zhì)表面的組氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巰基和色氨酸吲哚基發(fā)生親和結(jié)合作用。許多蛋白質(zhì)和肽類分子表面都不同程度地含有暴露的組氨酸、半胱氨酸和色氨酸，這些氨基酸能與二價金屬離子發(fā)生螯合作用。因此可利用金屬螯合色譜得以分離純化。親和層析介質(zhì)親和配基常用的親和配基：組氨酸組氨酸具有比較獨特的性質(zhì)，可與蛋白質(zhì)發(fā)生親和結(jié)合作用。在低鹽和pH約等于目標蛋白質(zhì)等電點的溶液中，固定化組氨酸的親和吸附最強，隨鹽濃度的增大，親和吸附作用降低。根據(jù)此特性，利用組氨酸為配基可親和分離等電點相差較大的蛋白質(zhì)。親和層析介質(zhì)親和配基常用的親和配基：色素配基三嗪類色素是一類分子內(nèi)含有三嗪環(huán)的合成活性染料，與各種需要在NAD的存在下表現(xiàn)其生物活性的脫氫酶和激酶具有結(jié)合作用。這類色素與NAD的結(jié)合部位相同，具有抑制酶活性的作用。利用色素為配基的親和色譜法一般稱作色素親和色譜。親和層析介質(zhì)親和配基常用的親和配基：其它配基肝素：為酸性多糖，具有抗凝血作用。與脂蛋白、脂肪酶、限制性內(nèi)切酶、甾體受體、抗凝血酶、凝血蛋白質(zhì)等具有親和作用，可用作這些物質(zhì)的親和配基。多聚腺苷酸：用于信使RNA的結(jié)合蛋白、病毒RNA、與DNA有關(guān)的NRA酶、核酸抗體等生物活性物質(zhì)的色譜分離。親和層析介質(zhì)親和配基1.配基濃度對于親和力低的系統(tǒng)，為了取得較好的配體分離效果，必須提高載體上配基的有效濃度。2.空間障礙在制備有些吸附劑時需要在載體與配基之間插入一段適當長度的多烴鏈“手臂”，以增加與載體相連的配基的活動度并減輕載體的立體障礙。影響親和作用的因素3.配基與載體的結(jié)合位點在多肽或蛋白質(zhì)等大分子作配基時，必須使它以最少的鍵與載體連接。4.載體孔徑載體孔隙是配體向配基接近的運動通道，所以載體的孔徑大小對吸附劑的親和能力有決定性影響。影響親和作用的因素1.配基固相化（樣品制備、裝柱、平衡）2.親和吸附3.解吸附4.色譜柱再生親和色譜法的操作方法1.配基固相化將與純化對象有專一結(jié)合作用的物質(zhì)，連接在水不溶性載體上，制成親和吸附劑后裝柱（稱親和柱），用一定pH和離子強度的緩沖液對柱子進行平衡。2.親和吸附即進料和雜質(zhì)清洗。將含有目標產(chǎn)物的料液連續(xù)通入親和柱，目標產(chǎn)物吸附在柱上，之后用緩沖液淋洗色譜柱除去未被吸附的雜蛋白。親和色譜法的操作方法3.解吸附

解吸附即目標產(chǎn)物洗脫。用某種緩沖液或溶液通過親和柱，把吸附在親和柱上的目的產(chǎn)物洗脫出來。親和色譜法的操作方法4.色譜柱再生用幾倍體積的起始緩沖液進行再平衡，一般足以使親和柱再生，但一些未知的雜質(zhì)往往仍結(jié)合在柱上，必須用苛刻的條件才能除去。根據(jù)載體材料的不同、配基的性質(zhì)以及它與載體連接方式的不同可酌情處理。親和色譜法的操作方法親和色譜具有特異性強、分離條件溫和、分離速度