擬柱胞藻的營養(yǎng)成分與培養(yǎng)

擬柱胞藻的營養(yǎng)成分與培養(yǎng)查廣才;楊東娟;鄒海鷹【摘要】通過純化濃縮，收集低鹽度養(yǎng)蝦池水體中的擬柱胞藻(Cylindrospermopsisraciborskii),分析擬柱胞藻營養(yǎng)成分與元素組成，結(jié)果顯示：藻體含碳42.67%、氫6.87%、氮8.80%,C/N比為4.85,粗蛋白含量為54.97%,粗脂肪含量為4.26%.藻體富含23種微量和稀有元素，其中重金屬Cr、Cu、Pb、Ni和Ti的含量較高，表明擬柱胞藻具有強的富集環(huán)境重金屬和耐污能力.通過改良稀釋Zarrouk培養(yǎng)基，在溫度為30(±1)°C、光照強度為20klx、100r/min的振蕩器中震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為10d,細(xì)胞培養(yǎng)密度達104個/mL,培養(yǎng)過群中藻絲形態(tài)會發(fā)生變化.【期刊名稱】《廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)》【年(卷)，期】2010(037)008【總頁數(shù)】3頁(P6-8)【關(guān)鍵詞】擬柱胞藻;營養(yǎng)組成;純化培養(yǎng)【作者】查廣才;楊東娟;鄒海鷹【作者單位】韓山師范學(xué)院生物系廣東，潮州,521041;韓山師范學(xué)院生物系廣東，潮州,521041;韓山師范學(xué)院生物系廣東，潮州,521041【正文語種】中文【中圖分類】Q949.22+5擬柱胞藻(Cylindrospermopsisraciborskii),又稱拉氏擬柱胞藻，為藍藻類原核生物，屬念珠藻目念珠藻科柱胞藻屬［1］。在不同的環(huán)境和生長條件下，同一種類的形態(tài)變化較大，因此，在我國擬柱胞藻有中華尖頭藻和拉氏擬魚腥藻等多個名稱［2-3］。擬柱胞藻在高水溫、富營養(yǎng)化的湖泊和水庫中生長良好，頻繁形成藻華［4-5］，是發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生毒素的最新藍藻種類，其產(chǎn)生的擬柱胞藻毒素是一種細(xì)胞毒素，能導(dǎo)致肝臟和腎臟損害［6-8］，對DNA和RNA都有損傷，但并不是所有種類都產(chǎn)生毒素。由于擬柱胞藻具有較強的入侵性，加之全球氣候變暖，其種群分布不斷由熱帶、亞熱帶向溫帶地區(qū)擴散［9-10］，我國的廣東、山東、浙江、云南、湖北及臺灣均有發(fā)現(xiàn)，且全球很多地區(qū)淡水飲水源地都發(fā)現(xiàn)有毒擬柱胞藻［11-12］，引起各國科學(xué)工作者的關(guān)注與研究，而擬柱胞藻在國內(nèi)的研究尚屬空白，對其元素組成及人工培養(yǎng)國內(nèi)還未見相關(guān)報道。本研究的擬柱胞藻取自珠海、中山等廣東珠三角地區(qū)凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)低鹽度養(yǎng)殖蝦池，該藻在低鹽度、高水溫、富營養(yǎng)化的蝦池環(huán)境中可形成高而穩(wěn)定的種群數(shù)量，但對對蝦的養(yǎng)殖表現(xiàn)為有益而不是有害［13］。為確定擬柱胞藻的生物學(xué)特性，本研究對擬柱胞藻的營養(yǎng)成分及元素組成進行了定量和定性分析，并實現(xiàn)該藻在實驗室條件下的人工純化培養(yǎng)，可為我國的環(huán)境保護、水產(chǎn)養(yǎng)殖及擬柱胞藻開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。1材料與方法1.1試驗材料擬柱胞藻分析測試樣品，于2005年4月取自廣東中山市橫欄鎮(zhèn)凡納濱對蝦低鹽度養(yǎng)殖蝦池，水樣取回實驗室靜置過夜，利用擬柱胞藻在靜置水體中漂浮并聚集于水面形成水華的特性，收集漂浮聚集在水面上的高純度擬柱胞藻，再通過8000r/min離心分離收集樣品，凍干保存。1.2試驗方法1.2.1擬柱胞藻碳、氫、氮含量測定稱取1.962mg擬柱胞藻凍干樣品，采用德國ElementarVarioEL元素分析儀測定C、H、N的含量。1.2.2粗脂肪含量測定稱取0.2g擬柱胞藻凍干樣品，加入10mL正己烷萃取，取正己烷萃取液，蒸干溶劑，稱重。1.2.3擬柱胞藻元素組成分析稱取0.4g擬柱胞藻凍干樣品，加高濃度的HNO3、HC1O4消化，溶液加熱溫度高于100°C，用水稀釋定容后發(fā)現(xiàn)有少量不溶物，過濾后取清液，根據(jù)JY/T015-1996(國家教委“感耦等離子體原子發(fā)射光譜方法通則”)，用全譜直讀等離子體原子發(fā)射光譜儀IRISAdvantage(HR)(美國ThermoJarrellAshCorporation)對其元素含量進行定性分析。1.2.4擬柱胞藻的培養(yǎng)(1)培養(yǎng)基配制。擬柱胞藻培養(yǎng)基的配制，首先配制Zarrouk培養(yǎng)基原液［14］和微量元素混合液(BaC12?H2O0.07g,Pb(NO3)20.099g,Na3AsO40.018g,Sr(NO3)20.063g,La(NO3)3?6H2O0.04g,SnC14?5H2O0.025g,蒸餾水定容至1L)，取微量元素混合液1mL,加入Zarrouk培養(yǎng)基原液，用蒸餾水定容至1L完成改良Zarrouk培養(yǎng)基的配制，將改良Zarrouk培養(yǎng)基稀釋10倍，用150mL三角錐形瓶分裝20mL,高溫滅菌后即可用于擬柱胞藻的培養(yǎng)。(2)分離純化。通過反復(fù)對比試驗，得到擬柱胞藻的有效分離純化方法：取少量樣品用培養(yǎng)基稀釋，最后用毛細(xì)管在顯微鏡下挑取單個目標(biāo)藻，并在載玻片上漂洗3~4次，洗去其他雜藻，最后挑取單個擬柱胞藻進行接種培養(yǎng)。(3)培養(yǎng)方法。擬柱胞藻實驗室培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度控制在30(±1)C,光照強度20kLx，光源為白熾燈，連續(xù)不間斷光照；將接種后的培養(yǎng)瓶置于恒溫振蕩器中震蕩培養(yǎng)(100r/min)。(4)擬柱胞藻的生長。取對數(shù)生長期的擬柱胞藻純培養(yǎng)液1mL(2.0x104個/mL)接種到新鮮培養(yǎng)液(每瓶20mL)中培養(yǎng)，每批接種5瓶，共培養(yǎng)3批。每天定時取樣,每個培養(yǎng)瓶重復(fù)計數(shù)3次，用20cmx20mm浮游生物計數(shù)框計數(shù)，每次取0.1mL培養(yǎng)液置于計數(shù)框，每個計數(shù)框在10x40倍顯微鏡下計數(shù)100個視野，還原為每毫升藻絲數(shù)量，連續(xù)觀察計數(shù)3個生長周期。2結(jié)果與分析2.1擬柱胞藻營養(yǎng)成分通過ElementarVarioEL和IRISAdvantage(HR)元素分析儀檢測分析，擬柱胞藻。、H、N3種主要元素的含量為：C42.67%,H6.87%,N8.80%,C/N為4.85，根據(jù)N含量推測粗蛋白質(zhì)含量為54.97%(N含量x6.25),粗脂肪含量的測定結(jié)果為4.26%，說明擬柱胞藻為一種高蛋白藻類，其粗蛋白和脂肪的含量接近人工培養(yǎng)的鈍頂螺旋藻［14］。2.2擬柱胞藻元素組成表1為擬柱胞藻除C、H、N3種主要元素以外不同含量范圍的元素組成，常量元素共8種，其中Al元素在其他藍藻體內(nèi)的含量并不高，在擬柱胞藻體內(nèi)檢測出較高含量，可能是該藻對環(huán)境中大量AI2+的富集作用所致，因為在擬柱胞藻的培養(yǎng)基中并不需要AI元素。在擬柱胞藻體內(nèi)微量和稀有元素多達23種，其中Ba、Cr、Cu、Mn、Ni、Pb、Sr、Ti、Zn等9種微量元素上升為次常量元素，含量顯著偏高，藻體內(nèi)還富含As、Ce、Co、La、Li、Mo、Nd、Sc、Sn、V、Y、Zr等12種微量元素。由擬柱胞藻的元素組成可知，該藻的生長需要大量微量元素和稀有元素，同時對一些常見有害元素Cr、Cu、Pb、As等具有明顯的富集作用和較強的耐受能力。表1擬柱胞藻元素組成含量范圍1x103-1x105pg/g30-1x103pg/g1~30pg/g元素Al、Ca、Fe、K、Mg、Na、P、SBa、Cr、Cu、Mn、Ni、Pb、Sr、Ti、ZnAs、B、Ce、Co、La、Li、Mo、Nd、Sc、Si、Sn、V、Y、Zr2.3擬柱胞藻純化培養(yǎng)擬柱胞藻目前較為有效的分離純化方法是用毛細(xì)管在顯微鏡下挑取單個目標(biāo)藻，并通過逐級稀釋和轉(zhuǎn)移，最后接種單個目標(biāo)藻到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。擬柱胞藻的培養(yǎng)需要較低的鹽度和豐富的微量元素，培養(yǎng)基是經(jīng)過改良的Zarrouk培養(yǎng)基。Zarrouk培養(yǎng)基用于螺旋藻培養(yǎng)，鹽度高，擬柱胞藻適宜的生長鹽度在0.5%。~2%。，必須經(jīng)過稀釋才能培養(yǎng)，但直接稀釋的Zarrouk培養(yǎng)基也培養(yǎng)不出擬柱胞藻，通過上述試驗結(jié)果與Zarrouk培養(yǎng)基成分對比分析，擬柱胞藻比螺旋藻需要更多種微量元素，根據(jù)擬柱胞藻體內(nèi)元素組成，篩選組合出不同于Zarrouk培養(yǎng)基的微量元素混合液，加入Zarrouk培養(yǎng)基中，稀釋10倍滅菌，可用于擬柱胞藻的培養(yǎng)，效果良好。擬柱胞藻生長需要較高的溫度、光強，同時需要不斷地攪動。擬柱胞藻的適宜生長溫度為30^左右，光照強度在20kLx，連續(xù)與間斷光照均可，與鈍頂螺旋藻培養(yǎng)條件類似；擬柱胞藻的培養(yǎng)需要不斷攪動或震蕩，靜置狀態(tài)還培養(yǎng)不出擬柱胞藻，攪動的主要作用是促進藻殖體的斷裂增殖。實驗室純培養(yǎng)的擬柱胞藻，擬柱胞藻的藻絲形態(tài)變化較大，有線型和螺旋卷曲兩種主要形態(tài)，在廣東珠江三角洲地區(qū)的低鹽度蝦池中以螺旋卷曲型為主，因此，本試驗的擬柱胞藻為螺旋卷曲型，但在培養(yǎng)過程中，有部分螺旋卷曲型轉(zhuǎn)變?yōu)榫€型藻絲。2.4擬柱胞藻生長規(guī)律擬柱胞藻在適宜的實驗室培養(yǎng)條件下，生長周期為10d，從接種時藻體數(shù)量1.0x103cells/mL到最大密度(3.3x104cells/mL)只需要1周時間，第8d藻體數(shù)量開始減少，第9d大部分藻體已解體，培養(yǎng)藻液由藍綠色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S褐色，藻絲也由緊密規(guī)則的螺旋轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷刹灰?guī)則螺旋，呈現(xiàn)明顯的老化。擬柱胞藻在適宜條件下種群增長快，有一個明顯的指數(shù)增長過程，但當(dāng)種群數(shù)量達到最大后，個體死亡分解呈直線下降，種群的崩潰和消亡發(fā)生在很短的時間內(nèi)。擬柱胞藻的個體增長與蝦池中所觀察到的種群增長規(guī)律一致，從蝦池中發(fā)現(xiàn)擬柱胞藻到形成高優(yōu)勢度的優(yōu)勢種，一般也只需要1周左右的時間，種群增長快，不同的是在蝦池中擬柱胞藻一旦形成優(yōu)勢種，其種群比較穩(wěn)定［13］。3結(jié)論與討論擬柱胞藻近幾年爆發(fā)于廣東珠三角地區(qū)低鹽度養(yǎng)殖對蝦中后期富營養(yǎng)化水體中。通過對蝦池中擬柱胞藻的樣品進行分析，發(fā)現(xiàn)擬柱胞藻的蛋白質(zhì)和脂肪等主要營養(yǎng)成分與人工大量生產(chǎn)的鈍頂螺旋藻比較接近，但微量和稀有元素的種類多，重金屬含量高；因為擬柱胞藻的個體小、生物量少以及人工培養(yǎng)擬柱胞藻的規(guī)模小，目前還沒有人工培養(yǎng)擬柱胞藻營養(yǎng)成分的分析結(jié)果，人工培養(yǎng)的擬柱胞藻和蝦池中的擬柱胞藻在營養(yǎng)成分及元素組成上存在何種差別，有還待進一步研究。在鈍頂螺旋藻的培養(yǎng)基中加7種不同的微量元素，降低鹽度即可實現(xiàn)擬柱胞藻的培養(yǎng)，盡管擬柱胞藻的培養(yǎng)需要大量的微量和稀有元素，但取自低鹽度蝦池的擬柱胞藻體的元素組成與培養(yǎng)基中的元素組成存在很大的差別，蝦池環(huán)境中擬柱胞藻體的重金屬種類和含量顯著高于培養(yǎng)基，稀有元素的種類也明顯曾多，說明擬柱胞藻對蝦池中的重金屬和微量元素具有明顯的富集作用和較強的耐受力。因此，擬柱胞藻的元素組成與其生長環(huán)境有密切關(guān)系，擬柱胞藻可替代鈍頂螺旋藻或其他藻類生物用于廢水處理和重金屬回收系統(tǒng)［14］。此外，大量的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，凡是以擬柱胞藻為優(yōu)勢種的蝦池，對蝦均生長健康良好，對低鹽度對蝦健康養(yǎng)殖有重要作用，相反，以有毒微囊藻為優(yōu)勢種的低鹽度蝦池，對蝦均發(fā)病死亡［13］，表明廣東珠三角地區(qū)蝦池中的擬柱胞藻沒有產(chǎn)生藍藻毒素，不同于其他環(huán)境中的種類［15］，但對其他陸生哺乳動物是否產(chǎn)生毒害，還有待進一步觀察。擬柱胞藻作為高蛋白低藻類，能否用于大規(guī)模生產(chǎn)，人工培養(yǎng)的擬柱胞藻營養(yǎng)組成是否對人和動物有益，也值得進一步研究。擬柱胞藻的純化培養(yǎng)是在高溫、強光、不斷震蕩的條件下完成。已有的研究表明，含有大量重金屬和豐富微量元素的低鹽度蝦池，養(yǎng)殖水溫在25~30°C，渦輪機械增氧，養(yǎng)殖中后期水體富營養(yǎng)化，這種低鹽度蝦池水體環(huán)境適宜擬柱胞藻的生長，部分蝦池出現(xiàn)擬柱胞藻形成的水華，但在水體鹽度超過6%。，沒有機械攪動增氧或沒有發(fā)生富營養(yǎng)化的蝦池，很少發(fā)現(xiàn)擬柱胞藻，因此，高水溫、低鹽度、機械攪動和富營養(yǎng)化是擬柱胞藻爆發(fā)的重要條件[13]；與蝦池中的擬柱胞藻相比，人工培養(yǎng)的擬柱胞藻藻絲明顯延長，螺旋數(shù)增多，且藻體中的大量氣泡消失。目前，在實驗培養(yǎng)條件下尚未發(fā)現(xiàn)藻絲產(chǎn)生異形胞，在晚秋的蝦池水體中發(fā)現(xiàn)部分藻絲兩端具異形胞，但實驗室培養(yǎng)和蝦池水體中均未發(fā)現(xiàn)有厚壁孢子的產(chǎn)生[16]。參考文獻：RebekahMK.ScientificName:Cylindrospermopsisraciborskii(Woloszyhska,1912),SeenayyaandSubbaRaju,1972[EB/OL]./res/Programs/ncrais/docs/factsheets/cylindrospermopsis_raciborskii.pdf,2007.項斯端，周麗蘋.拉氏擬魚腥藻的個體發(fā)育及其分類問題[J].植物分類學(xué)報,1990,28(5):341-344.ShafikHM,VorosL,SproberP,etal.SomespecialmorphologicalfeaturesofCylindrospermopsinraciborskiiinbatchandcontinuouscultures[J].Hydrobiologia,2003,506-509:163-167.SakerML,GriffithsDJ.OccurrenceofbloomsofthecyanobacteriumCylindrospermopsisraciborskii(Woloszynska)SeenayyaandSubbaRajuinanorthQueenslanddomesticwatersupply[J].MarineandFreshwaterResearch,2001,52(6):907-915.RyanEF,HamiltonDP,BarnesG.RecentoccurrenceofCylindrospermopsisraciborskiiinWaikatolakesofNewZealand[J].NewZealandJournalofMarineandFreshwaterResearch,2003,37:829-836.HongY,SteinmanA,BiddandaB,etal.Occurrenceofthetoxin-producingcyanobacteriumCylindrospermopsisraciborskiiinMonaandMuskegonLakes,Michigan[J].JournalofGreatLakesResearch,2006,32:645-652.BernardC,HarveyM,BriandJF,etal.ToxicologicalcomparisonofdiverseCylindrospermopsisraciborskiistrains:evidenceofliverdamagecausedbyFrenchC.raciborskiistrain[J].EnvironmentalToxicology,2003,18(3):176-186.SakerML,ThomasAD,NortonJH.CattlemortalityattributedtothetoxiccyanobacteriumCylindrospermopsisraciborskiiinanoutbackregionofNorthQueensland[J].EnvironmentalToxicology,1999,14(1):179-182.BriandJF,LeboulangerC,HumbertJF,etal.Cylindrospermopsisraciborskii(Cyanobacteria)invasionatmidlatitudes:selection,widephysiologicaltolerance,orglobalwarming[J].JournalofPhycology,2004,40(2):231-238.VidalL,KrukC.Cylindrospermopsisraciborskii(Cyanobacteria)extendsitsdistributiontoLatitude34°53’S:taxonomicalandecologicalfeaturesinUruguayaneutrophiclakes[J].Pan-AmericanJournalofAquaticSciences,2008,3(2):142-151.WilliamWJ,SarahS.DistributionandAbundanceofCylindrospermopsisraci