葉綠體的分離與熒光觀察

關(guān)于葉綠體的分離與熒光觀察第1頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月目的要求基本原理實驗用品方法與步驟實驗結(jié)果實驗報告第2頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗?zāi)康?．通過植物細(xì)胞葉綠體的分離了解細(xì)胞器分離的一般原理和方法2．了解熒光顯微鏡的使用原理和方法3．觀察葉綠體的自發(fā)熒光和次生熒光第3頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗原理將組織勻漿后懸浮在等滲的介質(zhì)中進行差速離心，是分離細(xì)胞器的常用方法。在一給定的離心場中同一時間內(nèi)，密度和大小不同的顆粒其沉降速率不同。依次增加離心力和離心時間就能使非均一懸浮液中的顆粒按照大小、密度先后沉降在離心管底部。第4頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月熒光顯微術(shù)是利用熒光顯微鏡對可發(fā)熒光的物質(zhì)進行觀測的一種技術(shù)。某些物質(zhì)在一定短波長的光的照射下吸收光能進入激發(fā)態(tài)，從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時能在短時間內(nèi)放射出比照射波長更長的光（如可見光），稱為熒光。有些生物體內(nèi)物質(zhì)受激發(fā)光照射后可直接發(fā)出熒光，稱自發(fā)熒光，如葉綠素的火紅色第5頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月材料本身不發(fā)熒光，但吸收熒光染料后同樣也能發(fā)熒光，稱次生熒光，如葉綠體吸收吖啶橙后發(fā)的橘紅色熒光。第6頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗方法1．選取新鮮的嫩菠菜葉，洗凈擦干后去除葉梗及粗脈，稱40克于150ml0.35mol/lNaCL中，裝入組織搗碎機低速勻漿5min，將勻漿用6層紗布過濾于500ml燒杯中。然后用手動勻降器手動勻漿2到3min。2．取濾液4ml在1000r/min下離心2min，棄取沉淀第7頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月3．將上清液在3000r/min下離心5min，棄上清，沉淀即為葉綠體（混有部分細(xì)胞核）4．將沉淀用0.35mol/lNaCL溶液懸浮第8頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月5．取葉綠體懸液一滴滴于載片上，加蓋片后可在光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察①在普通光鏡下觀察②在熒光顯微鏡下觀察③滴加一滴0.01%吖啶橙熒光染料，熒光顯微鏡下觀察第9頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗結(jié)果普通光鏡下可看到葉綠體為綠色橄欖形，高倍鏡下可看到葉綠體內(nèi)部有較深的小顆粒，就是基粒。熒光顯微鏡下葉綠體發(fā)火紅色熒光，加吖啶橙后發(fā)出橘紅色熒光，其中混有的細(xì)胞核則發(fā)綠色熒光。第10頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗報告

1、觀察葉綠體的形態(tài)結(jié)構(gòu),測量5~10個葉綠體的長軸和短軸求其平均值。2、記錄熒光顯微鏡下觀察的葉綠體自發(fā)熒光和次生熒光現(xiàn)象，分析結(jié)果。第11頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞的凝集反應(yīng)第12頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月目的要求基本原理實驗用品方法與步驟實驗結(jié)果實驗報告第13頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗?zāi)康睦斫饽厥辜?xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)的原理，觀察細(xì)胞的凝集現(xiàn)象。第14頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗原理細(xì)胞膜是雙層脂鑲嵌蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，脂和蛋白質(zhì)又能與糖分子結(jié)合為細(xì)胞表面的分枝狀糖外被。目前認(rèn)為：細(xì)胞之間的聯(lián)系，細(xì)胞的生長的分化，免疫反應(yīng)和腫瘤發(fā)生都和細(xì)胞表面的分枝狀糖分子有關(guān)。第15頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月

凝集素（lectin）是一類含糖的（少數(shù)除外）并能與糖專一結(jié)合的蛋白質(zhì)，它能具有凝集細(xì)胞和刺激細(xì)胞分裂的作用，凝集素使細(xì)胞凝集是由于他與細(xì)胞表面的糖分子連接，在細(xì)胞間形成“橋”的結(jié)果，加入與凝集素互補的糖可以抑制細(xì)胞的凝集。第16頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗用品1、材料：土豆塊莖2、器材和儀器：顯微鏡，粗天平，載玻片，滴管2支，離心管2支。3、PBS緩沖液稱取NaCl7.2g，Na2HPO41.48g，KH2PO40.43g，用蒸餾水定容至1000ml，調(diào)pH為7.2第17頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月4、2%的紅細(xì)胞以無菌方法抽取甲魚血（加抗凝劑），用生理鹽水洗5次，每次離心2000rpm，5min；之后按紅細(xì)胞壓積（紅細(xì)胞在血液中所占的容積比值稱為紅細(xì)胞壓積）用生理鹽水稀釋為2%的紅細(xì)胞懸液。第18頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗方法1、土豆凝集素的制備稱取去皮土豆塊莖2g，加10mlPBS緩沖液，浸泡2h，浸出的粗提液中即含有可溶性土豆凝集素。凝集反應(yīng)第19頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月用滴管吸取土豆凝集素和2%紅細(xì)胞懸液各一滴，置載玻片上，充分混勻，靜置20min后于低倍鏡下觀察血球凝集現(xiàn)象。以PBS液加2%紅細(xì)胞懸液作對照實驗。第20頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗結(jié)果相較于對照，加上凝集素后，許多雞紅細(xì)胞凝集在一起結(jié)成球狀。第21頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗報告簡圖表示紅細(xì)胞凝集原理。第22頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞膜的滲透性第23頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月目的要求基本原理實驗用品方法與步驟實驗結(jié)果實驗報告第24頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗?zāi)康?了解細(xì)胞膜的滲透性

2了解各物質(zhì)進入紅細(xì)胞的速度第25頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗原理

當(dāng)紅細(xì)胞置于不同等滲溶液中時，由于對各種溶質(zhì)的通透性不同，因此有的溶質(zhì)分子可透入，有的溶質(zhì)分子則不能透入，能透人的溶質(zhì)分子的速度也不同。當(dāng)溶質(zhì)分子進入紅細(xì)胞使細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度增加時，導(dǎo)致水的攝人。第26頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月紅細(xì)胞膨脹到一定程度時，細(xì)胞膜破裂，即紅細(xì)胞發(fā)生溶血.由于溶質(zhì)透人速度不同，溶血時間也不同。第27頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗用品

試劑：0.17mol／L氯化鈉，0.17mol／L氯化銨，0.17mol／L硝酸鈉，0.12mol／L硫酸鈉，0.12mol／L草酸鈉，0.12mol／L醋酸鈉，0.32mol／L葡萄糖，0.32mol／L甘油，0.32mol／L乙醇，0.32mol／L丙醇。儀器：顯微鏡，載玻片，蓋玻片，吸管，小燒杯，試管，試管架第28頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗方法

1、低滲溶液：取試管1支，加入10mL蒸餾水，然后再加入1mL稀釋的雞血，注意觀察溶液的顏色變化，溶液由不透明的紅色變?yōu)榧t色透明，紅細(xì)胞發(fā)生破裂，造成所有紅細(xì)胞溶血，使光線容易通過。顯微鏡下觀察溶血前后紅細(xì)胞的形態(tài)。

第29頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月2、雞血紅細(xì)胞的滲透性：取試管10支，分別加入上述10種溶液各10mL，再加入1mL稀釋的雞血，記下時間，輕輕搖動使混勻，注意是否發(fā)生溶血；若發(fā)生溶血，記錄溶血過程所需的時間（自加入稀釋雞血到溶液變成紅色透明澄清所需時間）。第30頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗結(jié)果不同的試劑導(dǎo)致細(xì)胞的不同反應(yīng)。1，溶血，注意時間不同；2，不出現(xiàn)溶血，為什么？第31頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗報告第32頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞融合第33頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月目的要求基本原理實驗用品方法與步驟實驗結(jié)果實驗報告第34頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗?zāi)康?.了解PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合的原理2.掌握細(xì)胞融合技術(shù)第35頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗原理聚乙二醇(PEG)結(jié)構(gòu)為：HOH2C(CH20CH2)nCH2OH，相對分子質(zhì)量在200-6000均可，用作細(xì)胞融合劑。聚乙二醇分子能改變各類細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，使兩細(xì)胞接觸點處質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生疏散和重組，由于兩細(xì)胞接口處雙分子層質(zhì)膜的相互親和以及彼此的第36頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月表面張力作用，從而使細(xì)胞發(fā)生融合，進而細(xì)胞質(zhì)溝通，形成一個雙核或多核細(xì)胞第37頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗用品1.器材：離心機，移液槍，水渦鍋，載玻片，蓋玻片，血細(xì)胞計數(shù)板，刻度試管，刻度吸管，電爐，冷凍離心管，顯微鏡，燒杯，吸管2.試劑：Alsever溶液，GKN溶液，0.85%生理鹽水，50%PEG，蒸餾水第38頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月0.85％生理鹽水：0.85g氯化鈉溶于100mL重蒸水中。ALsver液：葡萄糖2.05g,枸櫞酸鈉0.8g,NaCl0.42加蒸餾水至100mlGKN液：NaCl8g，KCl0.4g,Na2HPO4·2H2O1.77g，NaH2PO4·H2O0.69g,葡萄糖2g,苯酚紅0.01g溶于1000ml蒸餾水中第39頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月50％PEG混合液：稱取少許PEG(Mw6000)放人刻度離心管內(nèi)，在沸水浴中加熱，使其溶化，待冷卻至50℃時，加入預(yù)熱至50℃的等體積的GKN液，混勻。注意使用前配制。第40頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗方法1.取新鮮的雞血與Alsever溶液以1：4的比例混勻，可在冰箱內(nèi)存放一周（4℃）2.取1ml貯存雞血加入4ml0.85%生理鹽水，充分混勻800r/min,3min棄上清，重復(fù)離心兩次。3.棄上清再加4mlGKN溶液離心，加GKN液，制成細(xì)胞懸液。第41頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月4.取上述細(xì)胞懸液1ml與刻度試管中，用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，用GKN液將其調(diào)整為5×106個/ml5.取上述細(xì)胞懸液1ml于另一刻度試管中，放入37℃水浴中，浴熱20min，PEG液也浴熱20min第42頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月6、20min后，將0.5ml50%PEG液逐滴沿管壁加入到1ml細(xì)胞懸液中，邊加入邊搖勻，然后再放入37℃水浴中保溫20min。7、20min后，取少量于載玻片上，置顯微鏡下觀察。第43頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗結(jié)果顯微觀察，應(yīng)發(fā)現(xiàn)一些多核和雙核的較大的細(xì)胞。表明細(xì)胞發(fā)生了融合。第44頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗報告第45頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月線粒體的分離與觀察第46頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月目的要求基本原理實驗用品方法與步驟實驗結(jié)果實驗報告第47頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗?zāi)康?、了解差速離心法分離線粒體的方法2、學(xué)習(xí)體外活染的方法第48頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗原理差速離心：在一定的離心場中，球形顆粒的沉降速度取決于它的密度、半徑和懸浮介質(zhì)的黏度。在一均勻介質(zhì)中離心一定時間內(nèi)，組織勻漿中的各種細(xì)胞器及其他內(nèi)含物由于沉降速度不同將停留在高低不同的位置。依次增加離心力和離心時間就能夠使這些顆粒按其大小、重分批沉降在離心管底部，從而分批收集。第49頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月懸浮介質(zhì)：通常用緩沖的蔗糖溶液，它比較接近細(xì)胞質(zhì)的分散相，在一定程度上能夠保持細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和酶的活性。詹納斯活染：詹納斯綠B是對線粒體專一的、毒性很小的、活性染料，由于其堿性，解離后第50頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月帶正電，由電性吸引堆積在線粒體膜上。線粒體的細(xì)胞色素氧化酶使該染料保持在氧化狀態(tài)呈現(xiàn)藍綠色從而使線粒體顯色，而細(xì)胞質(zhì)中的染料被還原成無色。第51頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗用品綠豆芽、燒杯、勻漿機、紗布、剪刀、1%詹納斯綠B、0.25M蔗糖+0.01MTris-Hcl緩沖液、低/高速離心機、顯微鏡、玻片、濾紙第52頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗方法1、選取鮮嫩的綠豆芽用剪刀剪取芽體約30克加入200ml0.25M蔗糖tris-Hcl緩沖溶液，裝入組織搗碎機勻漿，將搗碎液用6層紗布過濾于燒杯中。2、取濾液5ml于離心管中，1500r/min離心10min。第53頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月3、取上清1ml于EP管中，13300r/min離心10min，棄上清。4、將沉淀用1ml緩沖液懸浮，然后13300r/min離心10min，棄上清，沉淀即為線粒體。第54頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月5、取沉淀涂片，不待干即滴加詹納斯綠B染20min，蓋上蓋玻片，鏡檢。6、注意整個操作過程應(yīng)注意使樣品保持4攝氏度左右，避免酶失活。涂片時勿太濃密第55頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗結(jié)果線粒體呈小棒狀或啞鈴狀，活的線粒體呈藍綠色，失活的線粒體透明。第56頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗報告第57頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月脂質(zhì)體的制備

第58頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月目的要求基本原理實驗用品方法與步驟實驗結(jié)果實驗報告第59頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)制備脂質(zhì)體的方法。第60頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗原理脂質(zhì)體常用類脂如磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、膽固醇等制備。其中最常用的是磷脂酰膽堿和膽固醇的混合物。利用磷脂的雙親分子特性，加入水相后形成囊狀或液晶態(tài)，用超聲波處理，磷脂類雙親媒性分子被打碎為分子或分子團，并自動重新排布成類似生物膜的雙分子層囊泡。第61頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗用品器材超聲波清洗機、光學(xué)顯微鏡、旋渦混合器、離心機、試管、Ep管、移液槍試劑磷脂液：100mg經(jīng)丙酮-乙醚法純化的卵磷脂，57.2mg膽固醇，溶于1mL氯仿。第62頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月Tris緩沖液：稱取Tris0.12g,EDTA0.288mg,溶于80mL去離子水中，用0.1mol/L鹽酸調(diào)pH7.2，再加水至100mL。1%番紅花紅染液。第63頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月實驗方法1．配制磷脂液、Tris緩沖液。2．取660μL磷脂液于一小試管中，加入番紅花紅染液500μL,再加入1060μLTris緩沖液。3．將混合液旋渦混合1min,然后于超聲波清洗機中處理10min,取出靜置30min,可見液體分為三層。第64頁，課件共73頁，創(chuàng)作于2023年2月4．取中層液體20μL于Ep管中，再加入550μLTris緩沖液，5000rpm離心3min,取下層觀察。第65