菌種毒種蟲種

菌(毒、蟲)種的選育培養(yǎng)與保藏

一、生物制品菌(毒、蟲)種的分類生物制品中使用的菌(毒、蟲)種的范圍很廣泛，包括生產(chǎn)和檢定疫苗、毒素、類毒素、抗血清以及診斷用品等的菌(毒、蟲)種，并隨著生物制品種類的增多和生物制品技術(shù)的發(fā)展，菌(毒、蟲)種的內(nèi)容也會不斷增加。（一）、按菌(毒、蟲)種的毒力分類1、強(qiáng)毒菌(毒、蟲)種

是指具有強(qiáng)大致病力的菌(毒、蟲)種，一般免疫原性也良好，常用于制造某些滅活疫苗，抗血清以及疫苗效力檢驗(yàn)。2、弱毒菌(毒、蟲)種

是指對動物無致病力而具有一定免疫原性的菌(毒、蟲)種，主要用于制造弱毒活苗。（二）、按菌(毒、蟲)種的用途分類1、生產(chǎn)用菌(毒、蟲)種

是指用于生產(chǎn)生物制品的菌(毒、蟲)種，即指生產(chǎn)疫苗、抗毒素、類毒素、抗血清及診斷用品的菌、毒種。如生產(chǎn)豬瘟兔化弱毒疫苗用的豬瘟種毒，生產(chǎn)破傷風(fēng)類毒素的破傷風(fēng)菌種，生產(chǎn)炭疽抗血清的Ⅱ號炭疽桿菌C40～22菌種，制造牛型結(jié)核菌素的牛型結(jié)核桿菌菌種等．（二）、按菌(毒、蟲)種的用途分類2、檢定用菌(毒、蟲）種

是指用于檢定生物制品效力等菌(毒、蟲)種。如效力檢驗(yàn)中攻毒用的新城疫強(qiáng)毒，豬丹毒強(qiáng)毒菌種等。另外，還包括用于檢定診斷血清交叉反應(yīng)的菌（毒、蟲）種。3、工具用菌（毒、蟲）種是指在生物制品生產(chǎn)中作為工具使用的菌（毒、蟲）種。如基因工程中表達(dá)某些異種抗原用的宿主大腸桿菌、枯草桿菌、酵母菌等。二、生物制品中菌(毒、蟲)種的條件菌（毒、蟲）種是決定生物制品質(zhì)量的重要因素，懸于培養(yǎng)好的菌（毒、蟲）種也是生物制品工作中最重要的一環(huán)。好的菌（毒、蟲）種應(yīng)具備如下條件。（一）、具有良好的免疫原性由于生物制品主要是免疫制劑，故耍求菌(毒、蟲)種應(yīng)具有良好的免疫原性，使用后能產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫，并持續(xù)較長時間，同時對某些菌(毒，蟲)種而言還應(yīng)是抗原譜廣。一般來說，動物接種后產(chǎn)生80％以上的保護(hù)即為有良好的免疫原性。因?yàn)闄C(jī)體的免疫反應(yīng)是一個生物學(xué)過程，受到遺傳、環(huán)境等許多因素的影響，不論使用菌(毒、蟲)種的免疫原性多么好，都不可能一次使免疫動物獲得100％的保護(hù)。生物診斷用品的菌(毒、蟲)種應(yīng)以少量注入動物體內(nèi)就能產(chǎn)生強(qiáng)烈免疫反應(yīng)，這樣才能生產(chǎn)出既特異又靈敏的診斷用品。

（二）、具有可靠的安全性生物制品使用的菌(毒、蟲)種除具有良好的免疫原性外還應(yīng)安全。菌(毒、蟲）種的安全性主要與兩方面的因素有關(guān)，一方面是菌(毒、蟲)種本身的殘余毒力；另一方面是混有強(qiáng)毒或其他病原體。

殘余毒力是指減毒后的弱毒菌(毒、蟲)種仍殘存一定的毒力或致病力。如雞新城疫Ⅰ系弱毒疫苗種毒就保持較強(qiáng)的毒力，對雛雞接種后有致病性，而2個月齡以上的雞接種才安全。（二）、具有可靠的安全性在菌(毒、蟲)種的選育培養(yǎng)時，盡量降低毒力，保持良好的抗原性，使動物接種后既能產(chǎn)生良好的免疫，又不致于引起發(fā)病或損傷。而在實(shí)踐中，一般免疫原性與毒力呈正相關(guān)，免疫原性強(qiáng)毒力也強(qiáng)。如果采用某種方法使毒力降低，免疫原性也隨之降低。用于生產(chǎn)滅活疫苗的強(qiáng)毒都有很好免疫原性，而用于生產(chǎn)活疫苗的弱毒，免疫原性都有一定程度下降。這是選育培養(yǎng)菌(毒、蟲)種時需要注意和解決的一個矛盾，從某種意義上講安全更為重要。（二）、具有可靠的安全性在菌(毒、蟲)種的選育培養(yǎng)過程中還要避免污染強(qiáng)毒和其他病原體，尤其是用于活疫苗生產(chǎn)的菌(毒、蟲)種。因?yàn)樵谏a(chǎn)活疫苗時，不加任何滅活劑，使污染的強(qiáng)毒和病原體得不到應(yīng)有的處理。對于毒種來說，控制污染外源病原體是較難的。因?yàn)橛糜诓《九囵B(yǎng)的細(xì)胞、雞胚及動物不易做到完全無污染。（三）、具有典型的生物學(xué)性狀選育培養(yǎng)的菌(毒、蟲)種要有典型的生物學(xué)性狀，如形態(tài)、染色、培養(yǎng)特性、生化特性、抗原結(jié)構(gòu)、致病性、宿主適應(yīng)范圍、代謝產(chǎn)物、色素產(chǎn)生以及抵抗力等。這些生物學(xué)性狀是鑒別菌(毒、蟲)種的重要標(biāo)志，可用以區(qū)分其他微生物，進(jìn)而在生產(chǎn)和檢定生物制品時依據(jù)這些性狀來控制質(zhì)量。如果發(fā)現(xiàn)某些性狀改變就標(biāo)志著菌(毒、蟲)種發(fā)生了變異或發(fā)生外源污染，應(yīng)及時廢棄或更換，如果是用弱毒或無毒菌(毒、蟲)種生產(chǎn)生物制品，這些性狀也是區(qū)別強(qiáng)毒株的標(biāo)志，從而保證制品的安全性和免疫原性。（四）、具有遺傳穩(wěn)定性和一致性微生物在傳代和生產(chǎn)過程中，由于大量增殖時基因突變而表現(xiàn)出某些特性變異。如形態(tài)、生化特性、毒力、抗原性及藥物敏感性的變異。人工選育培養(yǎng)弱毒菌（毒、蟲)株就是利用毒力變異的特性在一定條件下經(jīng)多次傳代而使毒力減弱的。然而，選育出的菌(毒、蟲)種在用于生產(chǎn)時要注意具有穩(wěn)定的遺傳特性和保持微生物群體的一致性，尤其是毒力和免疫原性的遺傳穩(wěn)定性，以避免毒力返祖和免疫原性下降，從而確保生物制品的質(zhì)量。（四）、具有遺傳穩(wěn)定性和一致性一般采用限制菌(毒、蟲)種的傳代次數(shù)和培養(yǎng)條件來控制變異幅度，并定期進(jìn)行檢定。發(fā)現(xiàn)有性狀變化時可通過育種、傳代、蝕斑純化等方法來恢復(fù)性狀；如果在微生物群體中發(fā)現(xiàn)性狀不一致，可采用傳代和篩選等方法進(jìn)行純化，例如，細(xì)菌可挑選典型的單個菌落，病毒可挑選蝕斑進(jìn)行純化。菌(毒、蟲)種在遺傳上的穩(wěn)定性和一致性對生產(chǎn)至關(guān)重要。（五）、歷史及有關(guān)資料清楚完整對于菌(毒、蟲)種要有明確的來源，分離時動物病情及流行情況，傳代及生物學(xué)和免疫學(xué)特性，生產(chǎn)工藝質(zhì)量檢定，動物試驗(yàn)等各方面的研究資料和數(shù)據(jù)都應(yīng)完整。這樣的菌(毒、蟲)種方可用于生物制品。第一節(jié)細(xì)胞生物學(xué)研究的內(nèi)容與現(xiàn)狀生物制品用的菌(毒、蟲)種還應(yīng)該易于培養(yǎng)和大量繁殖，并能穩(wěn)定地達(dá)到和保持較高的滴度。用于生產(chǎn)類毒素和抗毒素的菌種，應(yīng)該能夠大量產(chǎn)生外毒素。對于某些生物制品還應(yīng)考慮提取、純化手段等。（六）、其他條件三、菌(毒、蟲)種的選育培養(yǎng)方法按著菌(毒、蟲)種的標(biāo)準(zhǔn)選育培養(yǎng)優(yōu)良的菌(毒、蟲)種是生物制品研究和生產(chǎn)的關(guān)鍵。選育培養(yǎng)方法一般有如下幾種。（一）、自然選育培養(yǎng)法人們對生物制品菌(毒、蟲)種的選育培養(yǎng)最先采用的方法就屬于自然選育培養(yǎng)法。遠(yuǎn)在15世紀(jì)，我國民間就用良好的天花患者的干燥痂皮研成粉末吹鼻免疫。100多年前，巴斯德就選用雞霍亂巴氏桿菌陳舊培養(yǎng)物制備疫苗，并獲得免疫成功。此后又有學(xué)者采用加熱殺死雞霍亂巴氏桿菌首次制成了死菌疫苗。自然選育培養(yǎng)法是對自然界中已存在的菌(毒、蟲)株進(jìn)行分離，從中選擇適于種用的菌(毒、蟲)株。一般常以感染的動物，媒介昆蟲以及污染物等獲得分離。（一）、自然選育培養(yǎng)法分離到菌(毒、蟲)株的毒力，抗原性往往都不同。某些自然分離的菌(毒、蟲)株毒力很強(qiáng)，如自然分離的多殺性巴氏桿菌等。這些強(qiáng)毒株適于制造滅活菌、診斷抗原和檢定用。有些自然分離菌(毒、蟲)株毒力很弱，抗原性也較好，如雞新城疫Bl株弱疫苗，L系弱毒、馬立克氏病SB-l弱毒株等，這些弱毒株適于制造弱疫苗。在自然弱毒中還包括由異種動物引用過來的菌(毒、蟲)株，如用火雞皰疹病毒預(yù)防雞馬立克氏病、鴿痘病毒預(yù)防雞痘，也有用牛病毒性腹瀉-粘膜病弱毒株預(yù)防豬瘟等。這些菌(毒、蟲)株是由于在自然條件下流行或傳代過程中適應(yīng)存在和變異的結(jié)果。（一）、自然選育培養(yǎng)法自然選育培養(yǎng)菌(毒、蟲)種時，首先從分離的菌(毒、蟲)株中選擇形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、理化特性典型的，并與相應(yīng)診斷血清出現(xiàn)明顯血清學(xué)反應(yīng)的菌(毒、蟲)株，然后再測定其毒力和免疫原性。測定時首先用實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行初選，然后再用原宿主動物測定。毒力測定一般是先選用敏感的實(shí)驗(yàn)動物，雞胚或細(xì)胞培養(yǎng)物等，測定菌(毒、蟲)株的半數(shù)致死量（LD50），最小致死量（MLD），半數(shù)感染量（ID50）或者是半數(shù)雞胚致死量（CELD50

），半數(shù)雞胚感染量（CEID50

）、半數(shù)細(xì)胞感染量（TCID50

）等。（一）、自然選育培養(yǎng)法在測定時，還應(yīng)設(shè)生理鹽水或培養(yǎng)液陰性對照和同種菌(毒、蟲)種的陰性對照，以免得出錯誤結(jié)論。如果陰性對照動物發(fā)病，則實(shí)驗(yàn)不能成立；如果陰性對照不發(fā)病，則對結(jié)論應(yīng)慎重。免疫原性測定是使對菌(毒、蟲)種免疫敏感的動物產(chǎn)生免疫力，然后再用強(qiáng)毒攻擊，如果動物不發(fā)病死亡則表明有一定的免疫原性。如果分離的菌(毒、蟲)株有數(shù)種，可分別免疫，然后交叉攻擊感染以確定抗原譜。作為菌(毒、蟲)種應(yīng)選用的免疫原性好，且抗原譜廣，能提供交叉保護(hù)的菌(毒，蟲)株。（一）、自然選育培養(yǎng)法在測定時，還應(yīng)設(shè)生理鹽水或培養(yǎng)液陰性對照和同種菌(毒、蟲)種的陰性對照，以免得出錯誤結(jié)論。如果陰性對照動物發(fā)病，則實(shí)驗(yàn)不能成立；如果陰性對照不發(fā)病，則對結(jié)論應(yīng)慎重。免疫原性測定是使對菌(毒、蟲)種免疫敏感的動物產(chǎn)生免疫力，然后再用強(qiáng)毒攻擊，如果動物不發(fā)病死亡則表明有一定的免疫原性。如果分離的菌(毒、蟲)株有數(shù)種，可分別免疫，然后交叉攻擊感染以確定抗原譜。作為菌(毒、蟲)種應(yīng)選用的免疫原性好，且抗原譜廣，能提供交叉保護(hù)的菌(毒，蟲)株。（二）、人工選育培養(yǎng)法由于死疫苗免疫效果不理想，而且反應(yīng)重，這便促使人們研究和使用弱毒活疫苗免疫。生產(chǎn)弱毒活疫苗所用的菌(毒、蟲)種只靠自然選育培養(yǎng)是遠(yuǎn)不能滿足要求的，因而開始了人工選育培養(yǎng)菌(毒、蟲)種。目前，在生產(chǎn)中用于制造疫苗菌(毒、蟲)種多為人工選育培養(yǎng)獲得。本法是生物制品菌(毒、蟲)種選育培養(yǎng)的最重要、最常用的方法。

（二）、人工選育培養(yǎng)法人工選育培養(yǎng)法就是分離的菌(毒、蟲)株在培養(yǎng)和傳代過程中采用某些理化和生物學(xué)方法誘發(fā)其發(fā)生變異，使毒力減弱或消失而仍保持一定的免疫原性。有的毒力致弱后毒力穩(wěn)定，用于制苗的代數(shù)不受限制；也有的在繼代時免疫性亦隨之喪失，制苗使用代數(shù)較窄。入選的微生物要經(jīng)過毒力和免疫原性穩(wěn)定性測定，在培養(yǎng)基中連續(xù)傳代后不改變的，說明穩(wěn)定性良好且有使用價值。人工選育培養(yǎng)菌(毒、蟲)種可具體分以下幾種方法。（二）、人工選育培養(yǎng)法1、物理學(xué)方法主要包括以下幾個方面。（1）溫度各種微生物都有其最適宜的生長繁殖溫度，如果改變溫度可引起發(fā)生變異，以適應(yīng)環(huán)境。再通過選擇生產(chǎn)性能比較穩(wěn)定的變異株，如巴斯德將炭疽桿菌培養(yǎng)于42℃育成減毒株，用于預(yù)防注射；豬肺疫內(nèi)蒙古系弱毒株也是經(jīng)高溫培養(yǎng)選育的。（二）、人工選育培養(yǎng)法（2）射線將微生物暴露于紫外線或χ射線、γ射線下，大大增強(qiáng)了微生物的突變頻率，可從中選出變異株。如制造乙型腦炎疫苗的2-8弱毒株就是采用紫外線處理和小鼠皮下傳代選育的。仔豬副寒C500號菌株選育過程中就使用了鈷γ

射線處理。（二）、人工選育培養(yǎng)法2、化學(xué)方法主要包括以下幾個方面。（1）改變培養(yǎng)時的氣體環(huán)境需氧菌培養(yǎng)在厭氧環(huán)境中，或厭氧菌培養(yǎng)在有氧環(huán)境中，也能夠逐漸適應(yīng)，產(chǎn)生變異株。如Stern在二氧化碳環(huán)境中選育出了無莢膜的炭疽桿菌變異株，

（二）、人工選育培養(yǎng)法（2）改變培養(yǎng)基的組成在細(xì)菌培養(yǎng)基中加入或去掉其中物質(zhì)可以引起變異，并使毒力下降，成為弱毒株。如馬流產(chǎn)C355弱毒株是在培養(yǎng)基中加入了醋酸鉈育成的；豬肺疫630弱毒株是在含海歐牌洗滌劑培養(yǎng)基中連續(xù)傳代育成的；豬丹毒G4T10弱毒株是在含維黃素的血瓊脂上培養(yǎng)選育的；Williams應(yīng)用亞硝酸和羥胺誘變選育了腺病毒株。能夠引起變異的化學(xué)物質(zhì)種類很多，除上述外還包括許多堿基化合物、烷基化合物以及吖啶類。（二）、人工選育培養(yǎng)法3、生物學(xué)方法主要包括以下幾個方面。（1）通過動物機(jī)體將強(qiáng)毒菌(毒、蟲)株通過非易感的動物機(jī)體，可以改變強(qiáng)毒株的毒力，使其成為弱毒株。如將豬瘟強(qiáng)毒通過兔體傳代使其成為豬瘟兔化弱毒用于疫苗生產(chǎn)，已在世界享有盛譽(yù)；通過鵪鶉成功地培育了雞痘鵪鶉化弱毒；通過豚鼠成功地培育了布氏桿菌羊五號弱毒株；通過乳兔成功地培養(yǎng)了豬地方性肺炎乳兔化弱毒株等。也可以通過雞胚培育弱毒株，如雞胚致弱的羊痘雞胚化弱毒。（二）、人工選育培養(yǎng)法（2）通過細(xì)胞培養(yǎng)物將強(qiáng)毒力菌(毒、蟲)株通過細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)傳代也可以使其毒力減弱或消失。如馬傳染性貧血驢白細(xì)胞弱毒株，山羊痘細(xì)胞弱毒株，通過豬腎細(xì)胞繼代的偽狂犬病弱毒株等。通過上述方法人工選育培養(yǎng)的菌(毒