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
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文檔簡介
關(guān)于實驗大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化第1頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)容一:大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備實驗目的實驗原理實驗儀器、材料、試劑實驗步驟
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4注意事項思考題
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6第2頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月實驗目的
掌握感受態(tài)細胞的概念及其意義。
掌握感受態(tài)細胞的制備原理與操作方法。第3頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月實驗原理感受態(tài):受體(或者宿主)最易接受外源DNA片段并實現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。它是由受體菌的遺傳性狀所決定的,同時也受菌齡、外界環(huán)境因子的影響。制備感受態(tài)的細胞一般選擇對數(shù)生長期,新鮮幼嫩的細胞是制備感受態(tài)細胞和進行成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。常用的感受態(tài)制備方法包括KCl、CaCl2等方法;后者因為操作簡便且符合大多數(shù)的分子克隆要求,因而被廣泛采用。第4頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月
CaCl2
法的基本原理:細菌處于低溫(0℃)和低滲的CaCl2溶液中,菌體膨脹,細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變,轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復合物黏附于菌體表面,在42℃進行短時間的熱激處理,促進DNA的吸收。實驗原理第5頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月CaCl2
法簡便易行,用CaCl2法制備的感受態(tài)細胞,可使每微克超螺旋質(zhì)粒DNA產(chǎn)生5106-2107個轉(zhuǎn)化菌落。在實際工作中,每微克有105以上的轉(zhuǎn)化菌落足以滿足一般的克隆實驗。
制備出的感受態(tài)細胞暫時不用時,加入占總體積15%的無菌甘油于-70℃,可以保存半年。實驗原理第6頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月提高轉(zhuǎn)化效率要考慮幾個重要因素:實驗原理
1、細胞生長狀態(tài)和密度:不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲于4℃的培養(yǎng)菌,最好從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。
細胞生長密度以剛進入對數(shù)生長期時為好,可通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600
來控制。DH5α菌株的OD600
為0.5時,細胞密度在5×107
個/ml左右。第7頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月2、質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度:用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應主要是超螺旋態(tài)DNA。轉(zhuǎn)化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比,但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時,轉(zhuǎn)化效率就會降低。
1ng的超螺旋態(tài)DNA即可使50μl的感受態(tài)細胞達到飽和。一般情況下,DNA溶液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的5%。實驗原理第8頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月
3、試劑的質(zhì)量:所用的試劑,如CaCl2
等均需是最高純度的,并用超純水配制,并用微孔濾膜過濾滅菌,最好分裝保存于干燥的冷暗處。實驗原理第9頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月4、防止雜菌和雜DNA的污染:整個操作過程均應在無菌條件下進行,所用器皿,如離心管,tip頭等最好是新的,并經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染,否則均會影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入,為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。實驗原理第10頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月實驗儀器、材料、試劑1、儀器:高壓滅菌鍋、恒溫水浴鍋、臺式
離心機、無菌操作臺、微量移液
器、恒溫搖床;2、材料:菌種E.coliDH5α;3、試劑:LB液體培養(yǎng)基、0.1MCaCl2。第11頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月
1、將E.coliDH5α單菌落接種于3mlLB培養(yǎng)液中,37℃震蕩培養(yǎng)過夜。2、取30μl液體培養(yǎng)液加入3mlLB液體培養(yǎng)基中,37℃下震蕩培養(yǎng),至光密度值OD600在0.5~0.6之間(5×107
個/ml)。
3、取1mlE.coli液體培養(yǎng)液于1.5ml的離心管中,4000rpm,4℃離心3min。實驗步驟第12頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月4、快速的吸除上清,向沉淀中加入1ml冰
冷的0.1MCaCl2溶液,使沉淀充分懸浮,動
作要輕柔,置于冰上30min,4000rpm,4℃離心3min。5、棄上清,加入lml凍存液(含15%甘油的0.1MCaCl2溶液)溶液,使沉淀充分懸浮,以每管0.1ml的規(guī)格分裝3管,凍存于-80℃,可保存4~6個月。實驗步驟第13頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月注意事項1、不要用經(jīng)過多次轉(zhuǎn)接或儲存與4℃的培養(yǎng)菌,最好從-80℃甘油保存的菌種中直接
轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細胞的菌液。2、細胞生長密度以剛進入對數(shù)生長期時為宜,可以通過監(jiān)測培養(yǎng)液的OD600控制。DH5α菌株的OD600為0.5時,細胞密度比
較合適。密度過高或不足均會影響轉(zhuǎn)化
效率。第14頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月注意事項3、進行熱激制備感受態(tài)細胞時要控制好
時間。4、懸浮細胞時動作要輕柔,以免造成菌
體破裂,影響轉(zhuǎn)化。第15頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月思考題1、影響感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率的因素有哪
些?第16頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月內(nèi)容二:質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化體篩選實驗目的實驗原理實驗儀器、材料、試劑實驗步驟
1
2
3
4注意事項思考題
5
6第17頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月實驗目的了解轉(zhuǎn)化的概念及其在分子生物學研究中
的意義。學習將外源質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入受體菌細胞及篩
選重組子的方法。第18頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月實驗原理轉(zhuǎn)化:指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組DNA導入細菌細胞,并使其生物學特性發(fā)生可遺傳的變化的過程,是基因工程等研究領域的基本實驗技術(shù)。
第19頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)化的方法:
(1)化學的方法(熱激法):使用化學試劑(如CaCl2)制備的感受態(tài)細胞,通過熱激處理將載體DNA分子導入受體細胞;
(2)電轉(zhuǎn)化法:使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細胞,通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導入受體細胞。實驗原理第20頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月用CaCl2處理大腸桿菌細胞使其處于感受態(tài)后,通過熱激處理可將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入細菌中。進入細菌細胞的質(zhì)粒能夠自主復制并在宿主中實現(xiàn)其攜帶基因的轉(zhuǎn)錄、表達。實驗原理第21頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月實驗原理第22頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月轉(zhuǎn)化體的篩選方法:主要用不同抗生素基因篩選。
常用的抗生素有:氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等。實驗原理第23頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月如果將轉(zhuǎn)化后的菌液涂在無選擇性抗生素的培養(yǎng)基平板上,會出現(xiàn)成千上萬的細菌菌落,將難以確認哪一個克隆含有轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細胞在選擇性抗生素培養(yǎng)基中培養(yǎng),才能較容易地篩選出轉(zhuǎn)化體,即帶有異源DNA分子的受體細胞。實驗原理第24頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月本實驗使用的pGEX-4T-2質(zhì)粒帶有氨芐青霉素抗性基因(Amp),理論上只有轉(zhuǎn)入了質(zhì)粒的大腸桿菌才能在含Amp的培養(yǎng)基生長。但抗性篩選只是初步的篩選,可能仍有部分未轉(zhuǎn)進質(zhì)粒的細菌能在抗性培養(yǎng)基上生存(假陽性),因此還需要通過提取質(zhì)粒酶切、電泳作進一步的鑒定。實驗原理第25頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月實驗儀器、材料、試劑1、儀器:恒溫搖床,恒溫水浴鍋,電熱恒溫培養(yǎng)箱,無菌工作臺,微量移液槍。2、材料:DH5α感受態(tài)細胞、質(zhì)粒pGEX-4T23、試劑:LB液體及固體培養(yǎng)基、氨芐青霉
素Amp(50mg/ml)。第26頁,課件共28頁,創(chuàng)作于2023年2月實驗步驟1、每100ul感受態(tài)細胞加入1ul質(zhì)粒DNA,
同時做一個空
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