實(shí)驗(yàn)生物顯微制片技術(shù)

關(guān)于實(shí)驗(yàn)生物顯微制片技術(shù)第1頁(yè)，課件共25頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求1.理解石蠟切片法各主要步驟的基本原理。2.掌握各種試劑的配制和各種器材的使用方法。3.掌握石蠟切片法的具體操作方法。4.熟悉實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)注意的事項(xiàng)。5.自己取材，植物、動(dòng)物材料制備標(biāo)本片。6.通過(guò)在顯微鏡下觀察魚肝細(xì)胞染色玻片標(biāo)本，了解魚肝細(xì)胞的顯微結(jié)構(gòu)。第2頁(yè)，課件共25頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月生物制片技術(shù)概述生物顯微制片技術(shù)是觀察研究細(xì)胞、組織、胚胎、動(dòng)物等的形態(tài)、結(jié)構(gòu)及病理變化的重要方法。由于生活時(shí)的生物體器官組織過(guò)大或過(guò)厚不能在光學(xué)顯微鏡下觀察，或者能放在光學(xué)顯微鏡下，光線也不能透過(guò)，而且一些微細(xì)結(jié)構(gòu)的折光率相同，即使光線能夠透過(guò)也看不清楚。因此，就必須運(yùn)用顯微技術(shù)中各種方法將其制成玻片標(biāo)本，使組織細(xì)胞既能在光學(xué)顯微鏡下觀察又可長(zhǎng)期保存，結(jié)構(gòu)對(duì)比變明顯。一般可分為切片法和非切片法兩類制片方法。第3頁(yè)，課件共25頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月切片法：石蠟切片法；火棉膠切片法；冰凍切片法等。非切片法：包括整體封藏法；涂布法；壓片法，此外還有鋪片、磨片等。顯微制片需經(jīng)歷一系列操作，相當(dāng)細(xì)致而復(fù)雜，每一步驟的失誤都可導(dǎo)致整體的失敗，因此需要耐心細(xì)致，手腦并用。切片法：取材→固定→沖洗→脫水→透明→包埋→切片→染色→脫水→透明→封藏。非切片法：取材→固定→沖洗→脫水→透明→染色→脫水→透明→封藏第4頁(yè)，課件共25頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月切片法與非切片法比較切片法能顯示出組織、細(xì)胞內(nèi)部的微細(xì)結(jié)構(gòu),且對(duì)比非常明顯清晰。但操作步驟多,手續(xù)復(fù)雜,制片速度慢,耗時(shí)較長(zhǎng)。如洋蔥根尖縱切片中對(duì)線粒體、有絲分裂的觀察;小麥葉片橫切和玉米葉橫切中對(duì)細(xì)胞木質(zhì)化細(xì)胞質(zhì)、纖維素細(xì)胞質(zhì)的觀察。切片法是生物顯微制片技術(shù)中最常用和最主要的方法,其中又以石蠟切片法最為重要。非切片法能保持生物體或某部分器官組織的原有狀態(tài)及其完整性,但因不經(jīng)過(guò)切片手續(xù),不僅不能清晰地顯示各器官組織之間的相互關(guān)系,更無(wú)法顯示組織和細(xì)胞之間的結(jié)構(gòu)關(guān)系。非切片法中整體切片法僅能對(duì)很小的材料制片,如人體口腔上皮裝片,草履蟲裝片。涂片法僅對(duì)含有大量水分或完全為液體的組織或器官適用。第5頁(yè)，課件共25頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1非切片法1.1涂片法主要用于血液、精液、尿液、微生物液體培養(yǎng)物等不能用切片法制成薄片的液態(tài)顆粒性材料，可在載玻片上涂成單層細(xì)胞，還可再經(jīng)固定，脫水，染色等手段制成永久標(biāo)本。1.2鋪片法主要用于動(dòng)、植物組織的表皮層觀察，可活體取待觀察動(dòng)、植物組織，用尖鑷子撕去一層表皮，迅速平鋪在載玻片上。如:洋蔥表皮細(xì)胞的鋪片制備。第6頁(yè)，課件共25頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月1.3壓片法一些較幼嫩，柔軟的材料可將其置載玻片上，用小解剖刀將其分散，加染料一滴，再蓋上蓋玻片，用拇指垂直用力擠壓，使組織散成一薄片，再進(jìn)行觀察，如植物根尖壓片觀察染色體。1.4磨片用于質(zhì)地堅(jiān)硬的組織，如骨和牙。1.5離析法此法是利用化學(xué)試劑使組織的細(xì)胞間質(zhì)溶解，使組織分散成單個(gè)游離細(xì)胞。如植物去壁低滲法制備染色體標(biāo)本。第7頁(yè)，課件共25頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2切片法切片是供光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡觀察的動(dòng)植物組織薄片。

切片法是通過(guò)手工或切片機(jī)將組織切成薄片來(lái)進(jìn)行觀察的方法。需先經(jīng)過(guò)一系列步驟將組織內(nèi)滲入某些支持物質(zhì)，使組織變硬以利于切成薄片，根據(jù)所用支持劑的種類不同，可分為徒手切片法，石蠟切片法，火棉膠切法，冰凍切片法等類型，切成薄片后還需要去蠟，染色，脫水，透明等步驟。第8頁(yè)，課件共25頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月2.1石蠟切片法石蠟切片法包括以下各主要步驟：取材→固定→洗滌和脫水→透明→浸蠟→包埋→切片與粘片→脫蠟→染色→脫水→透明→封片等步驟。一般的組織從取材固定到封片制成玻片標(biāo)本需要數(shù)日，標(biāo)本片可以長(zhǎng)期保存使用。第9頁(yè)，課件共25頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月詳細(xì)步驟和各個(gè)環(huán)節(jié)要求取材：材料必須新鮮、完整，擱置時(shí)間過(guò)久則產(chǎn)生蛋白質(zhì)分解變性，導(dǎo)致細(xì)胞自溶及細(xì)菌的滋生，且避免擠壓、挫傷而不能反映組織活體時(shí)的形態(tài)結(jié)構(gòu)。注明采集時(shí)間、地點(diǎn)、名稱、組織部位等。組織塊大小以0.5×0.5×0.2cm為宜。固定：用化學(xué)藥液浸漬切成小塊的新鮮材料，迅速凝固或沉淀細(xì)胞和組織中的物質(zhì)成分、終止細(xì)胞的一切代謝過(guò)程、防止細(xì)胞自溶或組織變化，盡可能保持其活體時(shí)的結(jié)構(gòu)。此外固定還有使組織硬化作用，助染作用。此外還有物理方法如干燥、高熱和低溫驟冷等方法固定。第10頁(yè)，課件共25頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月洗滌與脫水：洗滌：固定后的組織材料需除去留在組織內(nèi)的固定液及其結(jié)晶沉淀，以免影響以后的染色效果。多以流水沖洗。脫水：洗滌后的組織內(nèi)充滿水分，需除去水分方可進(jìn)行之后的透明、浸蠟與包埋。脫水用一種既能與水又能與透明劑混溶的液體來(lái)逐漸置換樣品中游離的水。脫水劑常采用乙醇或丙酮、正丁醇、叔丁醇進(jìn)行梯度脫水。每次時(shí)間為1～數(shù)小時(shí)。脫水的過(guò)程：通常從30％或50％乙醇開(kāi)始，一般是30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→80%→90%→100%→100%脫水劑濃度不應(yīng)跨度太大，以免引起組織強(qiáng)烈的收縮或變形。第11頁(yè)，課件共25頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月

透明透明是用一種既能與脫水劑（乙醇）又能與包埋介質(zhì)（石蠟）互溶的液體來(lái)置換樣品中的脫水劑（乙醇），從而為最終的包埋創(chuàng)造一個(gè)有利的條件?，F(xiàn)采用的透明劑一般是二甲苯，甲苯，氯仿、香柏油等。一般過(guò)程為：1/3二甲苯+2/3乙醇混合液→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→2/3二甲苯+1/3乙醇混合液→二甲苯→二甲苯二甲苯是使用最廣泛的一種透明劑，滲透力強(qiáng)，溶蠟量大，易揮發(fā)，缺點(diǎn)是易使組織收縮，變硬，變脆。第12頁(yè)，課件共25頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月浸蠟將完成透明步驟的組織塊浸入透明劑與石蠟混合液中，梯度提高石蠟的比例，直至用石蠟完全置換組織塊中的透明劑，便于之后的包理與切片。浸蠟要在溫箱（60℃，液態(tài)石蠟）中進(jìn)行，每級(jí)1-3h。包埋樣品浸蠟后，內(nèi)部間隙已完全被石蠟占據(jù)，接著還需要用同種硬度的石蠟包埋成蠟塊以便切片。用鑷子輕輕將浸蠟后的組織塊夾入盛有液態(tài)石蠟的紙盒，擺好位置，待石蠟冷卻成固態(tài)即包埋完畢?？赏瑫r(shí)包埋多塊組織。至此，組織材料的前處理過(guò)程已完成，可用于切片。第13頁(yè)，課件共25頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月切片修塊：切片前需修整蠟塊，先將大塊蠟塊切開(kāi)，使每一小塊都含有一塊組織，再修整成正方體或長(zhǎng)方體，從切面看組織周圍的石蠟厚度相等(3mm)。固著：將修好的蠟塊粘在大小適宜的樣品臺(tái)（臺(tái)木）上，以便于固定在切片機(jī)上。切片：調(diào)整切片機(jī)刀片位置與臺(tái)木上的蠟面平行

。一手持毛筆，一手轉(zhuǎn)動(dòng)切片機(jī)，切下的蠟片連成一長(zhǎng)條蠟帶。切下的蠟帶根據(jù)需要切成數(shù)段，放在40℃水面上。貼片：蠟帶分別用粘片劑（蛋白甘油）貼在干凈載玻片上。在恒溫展片臺(tái)上展平，烘干。第14頁(yè)，課件共25頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月第15頁(yè)，課件共25頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月脫蠟、水化、染色蠟帶必須先用二甲苯去除石蠟再用乙醇去除二甲苯，再進(jìn)入水中，才能染色。染色的方法很多，要根據(jù)標(biāo)本要求顯示的目的選擇不同的染劑，最常用的是蘇木精-伊紅染色（H·E染色）。蘇木精使細(xì)胞核顯深紫色，伊紅使細(xì)胞質(zhì)顯粉紅色，可顯示清晰的細(xì)胞形態(tài)和核的大小，位置。染色后再使帶水的切片經(jīng)歷脫水→透明，最后用樹膠封片。第16頁(yè)，課件共25頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月HE染色：蘇木精（Hematoxylin）伊紅（Eosin）染色堿性染料將嗜堿性物質(zhì)（本身酸性）染成藍(lán)色酸性染料將嗜酸性物質(zhì)（本身堿性）染成紅色細(xì)胞核中的DNA、RNA細(xì)胞質(zhì)中的RNA細(xì)胞質(zhì)、膜性結(jié)構(gòu)（線粒體、溶酶體、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）第17頁(yè)，課件共25頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月(l)細(xì)胞核染色劑用于細(xì)胞核的染色劑有天然染色劑的蘇木精、洋紅以及合成染色劑中的番紅、結(jié)品紫、硫堇、甲苯胺藍(lán)、甲基綠、美藍(lán)、孔雀綠和焦油紫等。

(2)細(xì)胞質(zhì)染色劑用于細(xì)胞質(zhì)的染色劑有合成染色劑中的曙紅、亮綠、橘黃G、酸性品紅、苦味酸和水溶性苯胺藍(lán)等。（3）脂質(zhì)染色劑用于顯示脂質(zhì)的染色劑有合成染色劑中的蘇丹III、蘇丹Iv、硫酸尼羅藍(lán)及油紅等。第18頁(yè)，課件共25頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月其步驟如下：二甲苯→二甲苯→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→100%乙醇→95%乙醇→85%乙醇→70%乙醇→50%乙醇→30%乙醇→蘇木精染液→0.01%鹽酸→0.01%氫氧化鈉→蒸餾水→30%乙醇→50%乙醇→70%乙醇→85%乙醇→伊紅染液→95%乙醇→100%乙醇→100%乙醇→1/2二甲苯+1/2乙醇混合液→二甲苯→二甲苯→封片第19頁(yè)，課件共25頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月鏡檢、貼標(biāo)簽、干燥、記錄。第20頁(yè)，課件共25頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月3石蠟切片實(shí)例——魚肝制片材料：魚肝（厚2-3mm，carnoy3-4h/bouin/Zenker固定24h）。試劑：固定液，埃里希蘇木精染液，1%伊紅水溶液，1%鹽酸乙醇溶液，氨水，二甲苯，30%~100%各級(jí)乙醇，甘油蛋白粘片劑，中性樹膠。蘇木精為堿性染料（含陽(yáng)離子），伊紅為酸性染料，魚肝細(xì)胞核含酸性物質(zhì)，易與堿性染料的陽(yáng)離子結(jié)合染上藍(lán)色，胞質(zhì)含堿性物質(zhì)，易與酸性染料中陰離子結(jié)合而染上粉紅色。第21頁(yè)，課件共25頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月實(shí)驗(yàn)程序：取材（2-3×5×5mm3）→固定（carnoy3-4h，bouin12-24h）→洗滌（70%乙醇3-5次）→脫水（80%、90、100、100%乙醇各0.5h）→透明（乙醇+二甲苯等量混合15min，二甲苯15min2次）→透蠟（二甲苯+石蠟各半35-37℃,0.5h，石蠟56-60℃,0.5h2次）→包埋（凝30min）→切片（8μm，水面展開(kāi)）→貼片（涂粘片劑，滴水1滴）→展片（40-45℃）→烘干（37℃，24h）→脫蠟（二甲苯2-5min，二甲苯+乙醇2-5min）→復(fù)水（100%、90、80、70、50%、蒸餾水各2min）→染色（埃里希蘇木精染液15-20min）→水洗（2.5min換2次，共5min）→分色（分化，1%鹽酸乙醇溶液數(shù)秒，再水洗1min，染色合適可不做此步，）→藍(lán)化（氨水3-4s）→水洗（2次共5min）→復(fù)染色（1%伊紅水溶液1-5min）→脫水（50%數(shù)秒、70%、80%、100、100%乙醇各2min）→透明（乙醇+二甲苯5min，二甲苯5min2次）→封藏（中性樹膠50℃）。第22頁(yè)，課件共25頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4植物組織制片技術(shù)實(shí)例4.1徒手切片重要的是切下一小片平而薄的組織，而不是切下完整的組織片；左手持材料或夾持物（萵苣莖、胡蘿卜根、泡沫塑料等），右手平穩(wěn)持刀（刀片或手術(shù)刀），用臂力不用腕力；刀刃平置經(jīng)削平的平面上，輕輕壓住刀片，以均勻的力量平穩(wěn)的動(dòng)作，從刀刃的右側(cè)斜向左側(cè)切削，不可擠壓材料或拉鋸式切割；材料切面上和刀刃上保持有水，以免材料干枯；切片可簡(jiǎn)易染色1-2min，0.1%亞甲基藍(lán)，0.5%中性紅，1%番紅（木質(zhì)化細(xì)胞壁及核染成紅色）I2-KI溶液（淀粉粒藍(lán)色，核呈黃色）第23頁(yè)，課件共25頁(yè)，創(chuàng)作于2023年2月4.2石蠟切片法（根、莖、葉）顯微觀察，便于器官的立體重構(gòu)。硬質(zhì)材料可用滑走切片機(jī)，一般可用手搖切片機(jī)。程序：取材（0.5-1cm3）→固定（卡諾、FAA，2-24h，材料有空氣的需抽氣）→洗滌（70%乙醇2次）→脫水（80%、