酶類-膽堿酯酶

病理檢驗(yàn)技術(shù)

特殊染色

酶類膽堿酯酶膽堿酯酶

膽堿酯酶(cholinesterase)屬特異性酯酶,可分兩大類。一類為乙酰膽堿酯酶(簡(jiǎn)稱AChE),又稱真性膽堿酯酶；另一類為膽堿酯酶,又稱假性膽堿酯酶(簡(jiǎn)稱PsChE)。膽堿酯酶屬神經(jīng)系統(tǒng)中的羧基酯酶,乙酰膽堿酯酶能水解乙酰膽堿；假性膽堿酯酶能水解膽堿的酯,而不是水解乙酰膽堿酯。乙酰膽堿是由膽堿能神經(jīng)釋放出的一種神經(jīng)介質(zhì),正常的神經(jīng)沖動(dòng)常引起乙酰膽堿過(guò)量積聚,而乙酰膽堿酯酶則起生理的調(diào)節(jié)作用。膽堿酯酶

乙酰膽堿酯酶主要存在于神經(jīng)元的胞質(zhì)內(nèi)、神經(jīng)與肌肉接頭處即所謂運(yùn)動(dòng)終板處;膽堿酯酶主要存在于血漿、胰腺和唾液腺內(nèi),其生理功能尚不明確。兩者的化學(xué)性質(zhì)很不相同,膽堿酯酶常用的抑制劑是10-5mol/L毒扁豆堿(eserine),它可抑制乙酰膽堿酯酶和膽堿酯酶,而每10ml孵育液中加入0.2m1的0.004mol/L四異丙基焦磷酰胺可抑制膽堿酯酶而不抑制乙酰膽堿酯酶,是一種較理想的膽堿酯酶抑制劑。顯示乙酰膽堿酯酶的方法有多種,如Koell法,Snel和Garrett法、Gerebtzoff改良的Snell和Garrett法,Kamovsky和Roots法等,但后兩種方法較為可靠,特別是Janovsky和Roots的亞鐵氰化銅法,雖然其底物對(duì)組織的滲透性較差,但操作簡(jiǎn)便,酶的擴(kuò)散又少,是一種較好的方法。膽堿酯酶

亞鐵氰化銅法(根據(jù)Karnovsky和Roots)(一)試劑配制1.0.1mol/L醋酸鹽緩沖液(pH5.5)2.0.lmol/L檸檬酸鈉3.0.03mol/L硫酸銅4.0.005mol/L鐵氰化鉀5.0.004mol/L四異丙基焦磷酰胺6.孵育液7.Mayer蘇木精液膽堿酯酶

(二)染色步驟1.新鮮組織低溫恒冷切片(用液氮快速冷凍效果更佳),厚6μm,貼于玻片,取出風(fēng)扇吹干30分鐘。置于冷10%的甲醛鈣中固定10分鐘,蒸餾水洗3次,每次1分鐘。2.切片浸入預(yù)溫的孵育液于37℃孵育1~2小時(shí),至切片呈淡棕色時(shí)取出,蒸餾水洗后于鏡下觀察,如陽(yáng)性產(chǎn)物顏色仍較淡,可于蒸餾水洗后再進(jìn)行孵育,至反應(yīng)合適為止。3.流水沖洗5分鐘。4.Mayer蘇木精染胞核3分鐘。5.流水沖洗10分鐘。6.常規(guī)脫水透明,中性樹(shù)膠封固。膽堿酯酶（亞鐵氰化銅法(根據(jù)Karnovsky和Roots)）

(三)結(jié)果乙酰膽堿酯酶活性部位呈紅棕色至深粽色,細(xì)胞核藍(lán)色。(四)對(duì)照方法在孵育液內(nèi)加入10-5mol/L的毒扁豆堿,可同時(shí)抑制乙酰膽堿酯酶(AChE)和膽堿酯酶的(ChE)活性。膽堿酯酶（亞鐵氰化銅法(根據(jù)Karnovsky和Roots)）

圖亞鐵氰化銅法結(jié)腸黏膜，乙酰膽堿酯酶活性部位呈紅棕色

(五)注意事項(xiàng)1.配好后的孵育液應(yīng)為澄清透明的淡綠色,如出現(xiàn)混濁則應(yīng)重配。2.在配制孵育液時(shí),各試劑稱量要準(zhǔn)確,過(guò)多或過(guò)少對(duì)結(jié)果都有影響。3.本法各種試劑加入的順序是重要的,特別是硫酸銅,只能跟在檸檬酸鈉后加入,否則會(huì)降低孵育液內(nèi)銅離子的濃度。4.如要顯示假性膽堿酯酶,可用碘化丁酰硫代膽堿6mg代替碘化乙酰硫代膽堿5mg作為底物配制孵育液,并省去四異丙基焦磷酰胺。5.假性膽堿酯酶抑制劑四異丙基焦磷酰胺配成0.004molL溶液放冰箱保存,其他試劑如0.1mol/L醋酸鹽緩沖液,0.1mol/L檸檬酸鈉,0.030mol/L硫酸銅均密塞放4C的冰箱可保存約半年,0.005mol/L鐵氰化鉀放4℃的冰箱可保存約2~3個(gè)月。膽堿酯酶（亞鐵氰化銅法(根據(jù)Karnovsky和Roots)）

(六)染色機(jī)制乙酸膽堿酯酶水解碘化乙酰硫代膽堿,釋放出硫代膽堿和乙酸。硫代膽堿中的硫氫基（-SH）把鐵氯化鉀還原為亞鐵氰化鉀,后者與銅離子結(jié)合形成不溶性的紅粽色至深棕色的亞鐵氰化銅沉淀在酶活性部位而顯示出來(lái)。膽堿酯酶（亞鐵氰化銅法(根據(jù)Karnovsky和Roots)）

(七)應(yīng)用在中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)纖維都有乙酰膽堿酯酶的存在,因此,可利用乙酰膽堿酯酶染色觀察該酶在疾病時(shí)的改變,有助于巨結(jié)腸癥(Hirschspr