高三一輪復習生物：基因工程的基本工具和基本操作程序課件

第44講基因工程的基本工具和基本操作程序[課標要求]1.概述基因工程是在遺傳學、微生物學、生物化學和分子生物學等學科基礎上發(fā)展而來的。2.闡明DNA重組技術的實現(xiàn)需要利用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。3.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的獲取、基因表達載體的構建、目的基因導入受體細胞和目的基因及其表達產(chǎn)物的檢測鑒定等步驟。4.活動:DNA的提取和鑒定。5.活動:利用聚合酶鏈式反應(PCR)擴增DNA片段并完成電泳鑒定,或運用軟件進行虛擬PCR實驗。1.基因工程的概念解讀考點一重組DNA技術的基本工具目的基因基因重組分子2.基因工程的基本工具(1)限制性內(nèi)切核酸酶(也稱“限制酶”)。原核生物特定核苷酸序列黏性末端(2)DNA連接酶。磷酸二酯鍵黏性末端黏性末端(3)載體。質(zhì)粒噬菌體有一個至多個自我復制受體DNA標記[正誤辨析]1.切割質(zhì)粒的限制性內(nèi)切核酸酶均能特異性地識別6個核苷酸序列。(

)提示:大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成,也有少數(shù)限制酶的識別序列由4個、8個或其他數(shù)量的核苷酸組成。2.限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和質(zhì)粒是基因工程中常用的三種工具酶。(

)提示:質(zhì)粒不是工具酶,是工具?！痢?.E.coliDNA連接酶既可連接平末端,又可連接黏性末端。(

)提示:E.coliDNA連接酶只能連接黏性末端,而T4DNA連接酶能連接平末端和黏性末端。4.DNA聚合酶和DNA連接酶都能催化磷酸二酯鍵的形成。(

)5.載體質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為篩選的標記基因。(

)提示:質(zhì)粒上常有抗生素抗性基因等特殊的基因作為標記基因,而非抗生素合成基因。×√×[教材微點思考]1.(選擇性必修3P71正文拓展)限制酶主要來源于原核生物,為什么不能切割自身的DNA分子?提示:限制酶具有特異性,即一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列,并在特定位點進行切割。原核生物DNA分子中不存在自身限制酶的識別序列,或其識別序列已被修飾。2.(選擇性必修3P72正文拓展)DNA連接酶和DNA聚合酶功能上有何不同?提示:DNA連接酶連接的是兩個DNA片段,而DNA聚合酶是把單個的脫氧核苷酸連接到已有的DNA片段上;DNA聚合酶起作用時需要以一條DNA鏈為模板,而DNA連接酶不需要模板。1.與DNA有關的酶的比較酶種類作用底物作用部位作用結果限制酶DNA分子磷酸二酯鍵將DNA切成一個或多個片段DNA連接酶DNA分子片段磷酸二酯鍵將兩個DNA片段連接為一個DNA分子DNA聚合酶脫氧核苷酸磷酸二酯鍵以DNA單鏈為模板,將單個脫氧核苷酸依次連接到另一條短的單鏈末端解旋酶DNA分子堿基對中的氫鍵將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈,形成兩條長鏈DNA水解酶DNA分子磷酸二酯鍵將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸2.標記基因的作用標記基因可用于檢測目的基因是否導入受體細胞。3.限制酶的選擇構建基因表達載體時,需要選擇合適的限制酶切割含有目的基因的DNA片段和載體。已知限制性內(nèi)切核酸酶Ⅰ的識別序列和切點是,限制性內(nèi)切核酸酶Ⅱ的識別序列和切點是,根據(jù)圖示分析回答下列問題。(1)請用圖示法寫出限制性內(nèi)切核酸酶Ⅰ和限制性內(nèi)切核酸酶Ⅱ切割后形成黏性末端的過程。提示:限制性內(nèi)切核酸酶Ⅰ限制性內(nèi)切核酸酶Ⅱ(2)切割圖示中的目的基因和質(zhì)粒應選用哪類限制酶?請說明理由。提示:用限制酶Ⅱ切割目的基因,用限制酶Ⅰ切割質(zhì)粒。限制酶Ⅰ的識別序列包含限制酶Ⅱ的識別序列,因此限制酶Ⅱ也可切割限制酶Ⅰ的位點,故使用限制酶Ⅱ時,可在目的基因兩端同時切割,從而切出“目的基因”,但若使用限制酶Ⅱ切割質(zhì)粒,會同時破壞質(zhì)粒中的兩個“標記基因”,故只能使用限制酶Ⅰ切割質(zhì)粒。(1)不破壞目的基因原則:如圖甲中可選擇PstⅠ,而不選擇SmaⅠ。(2)保留標記基因(至少保留一個)、啟動子、終止子、復制原點原則:所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結構,如圖乙中不選擇SmaⅠ。(3)確保出現(xiàn)相同黏性末端原則:通常選擇與切割目的基因相同的限制酶切割質(zhì)粒,如圖中PstⅠ;為避免目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化和隨意連接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒,如圖也可選擇PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶。1.(2023·山西沂州期中)如圖表示由不同的限制酶切割而成的DNA末端及相關的酶作用位點。下列敘述錯誤的是(

)A.甲、乙、丙都屬于黏性末端B.甲、乙片段可形成重組DNA分子,但甲、丙不能C.DNA連接酶的作用位點在圖乙中b處D.切割甲的限制酶不能識別由甲、乙片段形成的重組DNA分子√基因工程中工具酶的應用甲、乙的黏性末端相同,因此可在DNA連接酶的作用下形成重組DNA分子,但甲、丙的黏性末端不同,它們之間不能形成重組DNA分子;DNA連接酶將兩個DNA片段連接為一個DNA分子,作用部位是磷酸二酯鍵,即圖乙中a處;切割甲的限制酶的識別序列為GAATTC∥CTTAAG,而甲、乙片段形成的重組DNA分子序列為GAATTG∥CTTAAC,因此切割甲的限制酶不能識別由甲、乙片段形成的重組DNA分子。解析2.(2023·江蘇鹽城調(diào)研)圖甲、乙中的箭頭表示三種限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點,AmpR表示氨芐青霉素抗性基因,neoR表示新霉素抗性基因。下列敘述錯誤的是(

)A.在構建重組質(zhì)粒時,可用PstⅠ和HindⅢ切割質(zhì)粒和外源DNAB.在酶切過程中,不能破壞質(zhì)粒中全部的標記基因C.若只用PstⅠ處理質(zhì)粒和外源DNA分子片段,無法避免自身環(huán)化和反向連接D.導入重組質(zhì)粒的大腸桿菌可以在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長√切割目的基因時,用BamHⅠ切割會破壞目的基因,只用PstⅠ切割目的基因和質(zhì)粒載體,會出現(xiàn)目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化,或目的基因和質(zhì)粒的反向連接,而用PstⅠ和HindⅢ進行酶切,能確保目的基因和質(zhì)粒的正向連接,并且質(zhì)粒上保留新霉素抗性基因作為標記基因;在酶切過程中,不能破壞質(zhì)粒中全部的標記基因,至少需保留其中的一個;用PstⅠ切割后,質(zhì)粒上氨芐青霉素抗性基因被破壞了,導入重組質(zhì)粒的大腸桿菌不可以在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長。解析3.(2023·遼寧凌源期中)將外源基因送入細胞通常是利用質(zhì)粒作為載體。下列有關質(zhì)粒的敘述,正確的是(

)A.質(zhì)粒上常有特殊的標記基因,以便于重組DNA分子的篩選B.質(zhì)粒從細胞中提取出來后即可以直接使用,無須人工改造C.質(zhì)粒是具有自我復制能力的DNA分子,只存在于原核生物中D.質(zhì)粒一般只有一個限制酶切割位點,以便于目的基因插入√載體的作用和特點質(zhì)粒一般需要經(jīng)過人工改造才可以使用;質(zhì)粒存在于真核細胞和原核細胞中;質(zhì)粒一般具有一個至多個限制酶切割位點,以供目的基因插入其中。解析1.目的基因的篩選與獲取(1)篩選合適的目的基因。①目的基因:在基因工程的設計和操作中,用于改變

或獲得

等的基因。主要是指

的基因。②篩選方法:從相關的已知結構和功能清晰的基因中進行篩選是較為有效的方法之一。考點二基因工程的基本操作程序受體細胞性狀預期表達產(chǎn)物編碼蛋白質(zhì)引物(2)利用PCR獲取和擴增目的基因。脫氧核苷酸耐高溫溫度兩種引物耐高溫的DNA聚合酶瓊脂糖凝膠電泳(1)在PCR過程中實際加入的為dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP),既可作為合成DNA子鏈的原料,又可為DNA的合成提供能量。(2)引物是一小段單鏈的DNA或RNA,作為新子鏈的合成起點,只能結合在母鏈的3′端,使DNA聚合酶能從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸。(3)真核細胞和細菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此,PCR反應緩沖溶液中一般都要添加Mg2+。2.基因表達載體的構建(1)構建基因表達載體的目的。①使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在,并且遺傳給下一代。②使目的基因能夠

和發(fā)揮作用。表達(2)基因表達載體的組成。RNA聚合酶轉錄啟動子、起始密碼子、終止子、終止密碼子的區(qū)別(3)基因表達載體的構建過程。生物種類植物動物微生物常用方法農(nóng)桿菌轉化法、

顯微注射法

處理法受體細胞

原核細胞轉化過程將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA中→農(nóng)桿菌→導入植物細胞→整合到受體細胞的染色體DNA上→表達將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物Ca2+處理細胞→細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)→基因表達載體導入3.將目的基因導入受體細胞花粉管通道法體細胞或受精卵Ca2+受精卵(1)農(nóng)桿菌特點。①能在自然條件下侵染雙子葉植物和裸子植物,而對大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力。②農(nóng)桿菌細胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒,當它侵染植物細胞后,能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA轉移到被侵染的細胞,并且將其整合到該細胞的染色體DNA上。(2)農(nóng)桿菌轉化法中的兩次拼接和兩次導入:第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上,第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T-DNA拼接到受體細胞的染色體DNA上;兩次導入:第一次導入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒導入農(nóng)桿菌,第二次導入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA導入受體細胞。(3)導入的目的基因,可能存在于細胞質(zhì)中,也可能整合到染色體DNA上。存在于染色體DNA上的目的基因有可能通過花粉傳播進入雜草或其他作物中,造成“基因污染”。4.目的基因的檢測與鑒定[正誤辨析]1.用PCR技術擴增目的基因時不必知道基因的全部序列。(

)2.利用PCR擴增目的基因時,要用2種不同但能夠互補配對的引物。(

)提示:PCR擴增目的基因時,2種不同的引物不能互補配對。3.外源DNA必須位于重組質(zhì)粒的啟動子和終止子之間才能進行復制。(

)提示:啟動子和終止子與外源DNA表達有關,控制轉錄過程;要進行復制,需要的是復制原點?！獭痢羀教材微點思考]1.(選擇性必修3P77正文拓展)PCR技術為什么需要引物?為檢測胚乳細胞中Wx基因是否表達,科研人員提取胚乳中的總RNA,經(jīng)逆轉錄過程獲得總cDNA,通過PCR技術可在總cDNA中專一性地擴增出Wx基因的cDNA,原因是什么?提示:DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA,只能從3′端延伸DNA鏈。引物是依據(jù)Wx基因的一段已知序列設計合成的(或引物能與Wx基因的cDNA特異性結合)。2.(選擇性必修3P81“資料卡”拓展)在用農(nóng)桿菌轉化法將目的基因導入植物細胞的過程中,為什么一定要將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上?提示:Ti質(zhì)粒的T-DNA也稱為可轉移的DNA,可轉移至受體細胞,并且整合到受體細胞染色體DNA上。1.PCR技術和DNA復制的比較2.PCR擴增過程中的循環(huán)圖示與規(guī)律循環(huán)次數(shù)123nDNA分子數(shù)2482n含引物A(或B)的DNA分子數(shù)1372n-1同時含引物A、B的DNA分子數(shù)0=21-22=22-26=23-22n-2共消耗的引物數(shù)量2=21+1-26=22+1-214=23+1-22n+1-21.農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉移并隨機插入被侵染植物的染色體DNA中。研究者將圖中被侵染植物的DNA片段連接成環(huán),并以此環(huán)為模板進行PCR,擴增出T-DNA插入位置兩側的未知序列,以此可確定T-DNA插入的具體位置。下列說法錯誤的是(

)A.PCR擴增依據(jù)的是DNA分子雙鏈復制的原理B.進行PCR擴增需要耐高溫的DNA聚合酶C.利用圖中的引物②③組合可擴增出兩側的未知序列D.通過與受體細胞的基因組序列比對,可確定T-DNA的插入位置√利用PCR獲取和擴增目的基因由于DNA的兩條鏈反向平行,且子鏈從引物的3′端開始延伸,故利用圖中的引物①④組合可擴增出兩側的未知序列。解析2.(2023·黑龍江大慶月考)通過引物設計,運用PCR技術可以實現(xiàn)目的基因的定點誘變,如圖為基因工程中獲取突變基因的過程,其中引物1序列中含有一個堿基T不能與目的基因片段配對,但不影響引物與模板鏈的整體配對,反應體系中引物1和引物2分別設計增加限制酶a和限制酶b的識別位點。下列有關敘述正確的是(

)A.限制酶a和限制酶b的識別位點分別加在引物1和引物2的3′端B.PCR反應體系中需要加入脫氧核苷酸、模板、Ca2+等C.第2輪PCR中,引物1與圖中②結合并形成兩條鏈等長的突變基因D.在第3輪PCR結束后,同時含引物1和引物2的DNA占3/4√DNA的合成方向是從子鏈的5′端向3′端延伸,據(jù)此可知,圖中限制酶a和限制酶b的識別位點分別加在引物1和引物2的5′端;PCR反應體系中需要加入模板、脫氧核苷酸、耐高溫的DNA聚合酶和擴增緩沖液(含Mg2+)等物質(zhì);第3輪PCR中,引物1與圖中②結合并形成兩條鏈等長的突變基因;在第3輪PCR結束后,會產(chǎn)生23=8(個)DNA分子,其中含有模板的DNA分子有2個只含有一個引物,則同時含引物1和引物2的DNA占3/4。解析基因工程的基本操作程序3.(2023·北京海淀二模)OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四個基因分別編碼四種不同的酶,研究人員將這些基因分別與葉綠體轉運肽(引導合成的蛋白質(zhì)進入葉綠體)基因連接,構建多基因表達載體(載體中部分序列如圖所示),利用農(nóng)桿菌轉化法轉化水稻,在水稻葉綠體內(nèi)構建了一條新代謝途徑,提高了水稻的產(chǎn)量。下列敘述正確的是(

)A.可用抗原—抗體雜交技術檢測四種酶在轉基因水稻中是否表達B.四個基因轉錄時都以DNA的同一條單鏈為模板C.應選用含卡那霉素的培養(yǎng)基篩選被農(nóng)桿菌轉化的水稻細胞D.四個基因都在水稻葉綠體內(nèi)進行轉錄翻譯√由題圖可知,在同一個T-DNA中OsGLO1啟動子啟動轉錄的方向與其他三個基因的不同,說明四個基因轉錄時并不都以DNA的同一條單鏈為模板;卡那霉素抗性基因不在T-DNA中,而潮霉素抗性基因在T-DNA中,應選用含潮霉素的培養(yǎng)基篩選被農(nóng)桿菌轉化的水稻細胞;由題意知,利用農(nóng)桿菌轉化法轉化水稻,可使目的基因插入水稻細胞中染色體的DNA上,所以與葉綠體轉運肽基因連接的四個基因,在水稻細胞核內(nèi)進行轉錄,在核糖體中進行翻譯。解析4.(多選)(2024·湖南衡陽月考)戊型肝炎病毒是一種RNA病毒,ORF2基因編碼的結構蛋白(pORF2)位于病毒表面,構成病毒的衣殼。我國科研人員利用基因工程技術,在大腸桿菌中表達pORF2,制備戊型肝炎疫苗,過程如圖。下列關于該疫苗的敘述正確的是(

)A.過程①需要的酶是RNA聚合酶,原料是A、U、G、CB.重組基因表達載體上的啟動子需來源于大腸桿菌C.過程⑤需要用聚乙二醇處理大腸桿菌使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)D.過程⑥大量制備pORF2蛋白前應做相應的檢測與鑒定√√戊型肝炎病毒是一種RNA病毒,過程①是以病毒RNA為模板合成DNA,獲取目的基因的過程,需要的酶是逆轉錄酶,原料是四種脫氧核苷酸;啟動子是一段有特殊序列結構的DNA片段,其作用是供RNA聚合酶的識別結合以驅動目的基因的轉錄,啟動子具有物種或組織特異性,構建在大腸桿菌細胞內(nèi)特異表達pORF2的載體時,需要選擇大腸桿菌細胞的啟動子,而不能選擇其他物種的啟動子;將目的基因導入微生物細胞的方法是Ca2+處理法,需要用Ca2+處理大腸桿菌,使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。解析1.DNA的粗提取與鑒定(1)基本原理。考點三DNA的粗提取與鑒定、DNA片段的擴增及電泳鑒定不溶于2mol/L二苯胺(2)操作流程。95％沸水提醒加入酒精和用玻璃棒攪拌時,動作要輕緩,以免加劇DNA分子的斷裂,導致DNA分子不能形成絮狀沉淀。2.DNA片段的擴增及電泳鑒定(1)實驗基礎。①PCR原理:利用了

原理。②電泳:DNA分子具有可解離的基團,在一定的pH下,這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下,這些帶電分子會向著與它所帶電荷

的電極移動,這個過程就是電泳。③PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的

等有關。DNA的熱變性相反大小和構象(2)PCR實驗操作步驟。微量移液器(3)DNA的電泳鑒定:凝膠中的DNA分子通過染色,可以在波長為

的紫外燈下被檢測出來。底部300nm[正誤辨析]1.用同樣方法從等體積兔血和雞血中提取的DNA量相近。(

)提示:哺乳動物(如兔)成熟的紅細胞無細胞核,細胞內(nèi)基本不含DNA。2.DNA析出過程中,攪拌操作要輕柔以防DNA斷裂。(

)3.在凝膠中DNA分子的遷移速率只與DNA分子的大小有關。(

)提示:在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構象等有關。×√×[教材微點思考]1.(選擇性必修3P74“探究·實踐”拓展)過濾研磨液用紗布不用濾紙的原因是什么?提示:DNA會吸附在濾紙上,影響提取DNA的量。2.(選擇性必修3P85“探究·實踐”拓展)如果電泳鑒定結果未出現(xiàn)擴增條帶,可能是哪些原因造成的?提示:未出現(xiàn)擴增條帶可能的原因有模板DNA含有雜蛋白或TaqDNA聚合酶的抑制劑;TaqDNA聚合酶失活;引物出現(xiàn)質(zhì)量問題,濃度不合適;Mg2+濃度過低;變性溫度低,變性時間短等。1.(2022·山東卷)關于“DNA的粗提取與鑒定”實驗,下列說法錯誤的是(

)A.過濾液沉淀過程在4℃冰箱中進行是為了防止DNA降解B.離心研磨液是為了加速DNA的沉淀C.在一定溫度下,DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍色D.粗提取的DNA中可能含有蛋白質(zhì)√DNA的粗提取與鑒定低溫時DNA酶的活性較低,過濾液沉淀過程在4℃冰箱中進行是為了防止DNA降解;離心研磨液是為了使細胞碎片沉淀;在沸水浴條件下,DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍色;細胞中的某些蛋白質(zhì)可以溶于酒精,但可能有的蛋白質(zhì)不溶于酒精,在95%的冷酒精中與DNA一塊兒析出,故粗提取的DNA中可能含有蛋白質(zhì)。解析2.(2023·山西晉城月考)如圖是“DNA的粗提取與鑒定”實驗中的兩個操作步驟示意圖。