蠟樣芽孢桿菌平板計(jì)數(shù)

蠟樣芽胞桿菌平板計(jì)數(shù)法（第一法）操作步驟樣品處理冷凍樣品應(yīng)在45°C以下不超過(guò)15min或在2℃?5°C不超過(guò)18h解凍，若不能準(zhǔn)時(shí)檢驗(yàn)，應(yīng)放于-10℃?-2CTC保存；非冷凍而易腐的樣品應(yīng)盡可能準(zhǔn)時(shí)檢驗(yàn)，若不能準(zhǔn)時(shí)檢驗(yàn)，應(yīng)置于2℃-5℃冰箱保存，24h內(nèi)檢驗(yàn)。樣品制備稱取樣品25g,放入盛有225mLPBS或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)，用旋轉(zhuǎn)刀片式均質(zhì)器以8000r/min?10000r/min均質(zhì)1min?2min,或放入盛有225mLPBS或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min?2mino若樣品為液態(tài)，吸取25mL樣品至盛有225mLPBS或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)可預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中,振蕩混勻，作為1:10的樣品勻液。423樣品的稀釋吸取中1:10的樣品勻液1mL加到裝有9mLPBS或生理鹽水的稀釋管中，充分混勻制成1:100的樣品勻液。跟據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估量，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無(wú)菌吸管或吸頭。樣品接種依據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估量，選擇2個(gè)?3個(gè)相宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），以0.3mL、0.3mL、0.4mL接種量分別移入三塊MYP瓊脂平板，然后用無(wú)菌L棒涂布整個(gè)平板，留意不要觸及平板邊緣。使用前，如MYP瓊脂平板表面有水珠，可放在25°C?50℃的培育箱里干燥，直到平板表面的水珠消逝。425分別、培育.1分別在通常狀況下，涂布后，將平板靜置10min。如樣液不易汲取，可將平板放在培育箱30℃±1℃培育1h，等樣品勻液汲取后翻轉(zhuǎn)平皿，倒置于培育箱，30℃±1°C培育24h±2ho假如菌落不典型，可連續(xù)培育24h±2h再觀看。在MYP瓊脂平板上，典型菌落為微粉紅色（表示不發(fā)酵甘露醇），四周有白色至淡粉紅色沉淀環(huán)（表示產(chǎn)卵磷脂酶X.2純培育從每個(gè)平板（符合要求的平板）中挑取至少5個(gè)典型菌落（小于5個(gè)全選）,分別劃線接種于養(yǎng)分瓊脂平板做純培育，30℃±1°C培育24h±2h,進(jìn)行確證明驗(yàn)。在養(yǎng)分瓊脂平板上，典型菌落為灰白色，偶有黃綠色，不透亮 ，表面粗糙似毛玻璃狀或融蠟狀，邊緣常呈擴(kuò)展?fàn)?，直徑?mm?10mm。確定鑒定染色鏡檢挑取純培育的單個(gè)菌落，革蘭氏染色鏡檢。蠟樣芽胞桿菌為革蘭氏陽(yáng)性芽胞桿菌，大小為（Rm~1.3pm）x（3|jm-5|jm）,芽胞呈橢圓形位于菌體中心或偏端，不膨大于菌體，菌體兩端較平整，多呈短鏈或長(zhǎng)鏈狀排列。生化鑒定概述挑取純培育的單個(gè)菌落，進(jìn)行過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、動(dòng)力試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、酪蛋白分解試驗(yàn)、溶菌酶耐性試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、葡萄糖采用（厭氧）試驗(yàn)、根狀生長(zhǎng)試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗(yàn)。蠟樣芽胞桿菌生化特征與其他芽胞桿菌的區(qū)分見(jiàn)表lo?-f???????- I—??- I I 荀萄糖利用（厭氧）++++一V-P試驗(yàn)++++一甘露科產(chǎn)酸一—一—+溶血（羊紅細(xì)胞）+++一根狀生長(zhǎng)一一+一一蛋白質(zhì)毒素晶體一+一一—注：+表示90%?100%的菌株陽(yáng)性；-表示90%?100%的菌株陰性；+/-表示大多數(shù)的菌株陽(yáng)性：T+表示大多數(shù)的菌株陰性。動(dòng)力試驗(yàn)用接種針挑取培育物穿刺接種于動(dòng)力培育基中，3CTC培育24h0有動(dòng)力的蠟樣芽胞桿菌應(yīng)沿穿刺線呈集中生長(zhǎng)，而蕈狀芽泡桿菌常呈"絨毛狀"生長(zhǎng)。也可用懸滴法檢查。血試驗(yàn)挑取純培育的單個(gè)可疑菌落接種于TSSB瓊脂平板上，30℃±1°C培育24h±2h。蠟樣芽胞桿菌菌落為淺灰色，不透亮 ，似白色毛玻璃狀，有草綠色溶血環(huán)或完全溶血環(huán)。蘇云金芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌呈現(xiàn)弱的溶血現(xiàn)象，而多數(shù)炭疽芽胞桿菌為不溶血，巨大芽胞桿菌為不溶血。根狀生長(zhǎng)試驗(yàn)挑取單個(gè)可疑菌落按間隔2cm?3cm左右距離劃平行直線于經(jīng)室溫干燥Id?2d的養(yǎng)分瓊脂平板上，30℃±1°C培育24h~48h,不能超過(guò)72h0用蠟樣芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌標(biāo)準(zhǔn)株作為對(duì)比進(jìn)行同步試驗(yàn)。蕈狀芽胞桿菌呈根狀生長(zhǎng)的特征。蠟樣芽胞桿菌菌株呈粗糙山谷狀生長(zhǎng)的特征。溶菌酶耐性試驗(yàn)用接種環(huán)取純菌懸液一環(huán)，接種于溶菌酶肉湯中，36℃±1V培育24h0蠟樣芽胞桿菌在本培育基（含0.001%溶菌酶）中能生長(zhǎng)。如消失陰性反應(yīng)，應(yīng)連續(xù)培育24h0巨大芽胞桿菌不生長(zhǎng)。4.326蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗(yàn)挑取純培育的單個(gè)可疑菌落接種于硫酸鎰養(yǎng)分瓊脂平板上,30℃±1°C培育24h±2h,并于室溫放置3d?4d,挑取培育物少許于載玻片上,滴加蒸微水混勻并涂成薄膜。經(jīng)自然干燥，微火固定后，加甲醇作用30s后傾去，再通過(guò)火焰干燥，于載玻片上滴滿0.5%堿性復(fù)紅，放火焰上加熱（微見(jiàn)蒸氣，勿使染液沸騰）持續(xù)1min?2min,移去火焰，再更換染色液再次加溫染色30s,傾去染液用干凈自來(lái)水徹底清洗、晾干后鏡檢。觀看有無(wú)游離芽胞（淺紅色）和染成深紅色的菱形蛋白結(jié)晶體。如發(fā)覺(jué)游離芽胞形成的不豐富，應(yīng)再將培育物置室溫2d?3d后進(jìn)行檢查。除蘇云金芽胞桿菌外，其他芽胞桿菌不產(chǎn)生蛋白結(jié)晶體。生化分型（選做項(xiàng)目）依據(jù)對(duì)檸檬酸鹽采用、硝酸鹽還原、淀粉水解、V-P試驗(yàn)反應(yīng)、明膠液化試驗(yàn)，將蠟樣芽胞桿菌分成不同生化型別，見(jiàn)表2。型別生化試驗(yàn)檸椽酸鹽硝酸鹽淀粉V-P明股1+++++2—++++3++—++4一一++5———++6+——++7+—+++8—+一4-+9—+——+10—++—+11+++—+12++——+13——+——14+———+15+一+—+注：+表示90%?100%的菌株陽(yáng)性：一表示90%?100%的菌株陰性。結(jié)果計(jì)算典型菌落計(jì)數(shù)和確認(rèn)選擇有典型蠟樣芽胞桿菌菌落的平板，且同一稀釋度3個(gè)平板全部菌落數(shù)合計(jì)在20CFU?200CFU之間的平板，計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)。假如消失a）~f）現(xiàn)象按中公式（1）計(jì)算，假如消失g）現(xiàn)象則按中公式（2）計(jì)算；a）只有一個(gè)稀釋度的平板菌落數(shù)在20CFU?200CFU之間且有典型菌落，計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；b）2個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)均在20CFU-200CFU之間，但只有一個(gè)稀釋度的平板有典型菌落，應(yīng)計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；c）全部稀釋度的平板菌落數(shù)均小于20CFU且有典型菌落，應(yīng)計(jì)數(shù)最低稀釋度平板上的典型菌落；d）某一稀釋度的平板菌落數(shù)大于200CFU且有典型菌落，但下一稀釋度平板上沒(méi)有典型菌落，應(yīng)計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；e）全部稀釋度的平板菌落數(shù)均大于200CFU且有典型菌落，應(yīng)計(jì)數(shù)最高稀釋度平板上的典型菌落；f）全部稀釋度的平板菌落數(shù)均不在20CFU?200CFU之間且有典型菌落，其中一部分小于20CFU或大于200CFU時(shí)，應(yīng)計(jì)數(shù)最接近20CFU或200CFU的稀釋度平板上的典型菌落。g）2個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)均在20CFU?200CFU之間且均有典型菌落。從每個(gè)平板中至少挑取5個(gè)典型菌落（小于5個(gè)全選），劃線接種于養(yǎng)分瓊脂平板做純培育，30℃±1°C培育24h±2ho式中：T——樣品中蠟樣芽胞桿菌菌落數(shù)；A——某一稀釋度蠟樣芽胞桿菌典型菌落的總數(shù)；B——鑒定結(jié)果為蠟樣芽胞桿菌的菌落數(shù)；C——用于蠟樣芽胞桿菌鑒定的菌落數(shù)；d——稀釋因子。l.ld式中：T——樣品中蠟樣芽胞桿菌菌落數(shù)；A1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）蠟樣芽胞桿菌典型菌落的總數(shù)；A2——其次稀釋度（高稀釋倍數(shù)）蠟樣芽胞桿菌典型菌落的總數(shù)；B1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）鑒定結(jié)果為蠟樣芽胞桿菌的菌落數(shù)；B2——其次稀釋度（高稀釋倍數(shù)）鑒定結(jié)果為蠟樣芽胞桿菌的菌落數(shù)；C1——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）用于蠟樣芽胞桿菌鑒定的菌落數(shù)；C2——其次稀釋度（高稀釋倍數(shù)）用于蠟樣芽胞桿菌鑒定的菌落數(shù)；1.1——計(jì)算系數(shù)（假如其