氨基酸的分離與鑒定

實(shí)驗(yàn)一氨基酸的分離與鑒定一一濾紙層析法目的要求（1） 通過實(shí)驗(yàn)，了解氨基酸濾紙層析法的原理。（2） 掌握氨基酸濾紙層析的操作方法。原理濾紙層析是以濾紙作為惰性支持物的分配層析（它也并存著吸附和離子交換作用）。濾紙纖維上羥基具有親水性，因此吸附一層水作為固定相，而通常把有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相。有機(jī)溶劑自上而下流動(dòng)稱為下行層析，自下而上流動(dòng)稱為上行層析。流動(dòng)相流經(jīng)支持物時(shí)，與固定相之間連續(xù)抽提，使物質(zhì)在兩相間不斷分配而得到分離。溶質(zhì)在濾紙上的移動(dòng)速率用Rf值表示：瞞_原點(diǎn)到屋折斑點(diǎn)中心的距離礙_ 原點(diǎn)到溶劑前緣的距籬溶質(zhì)結(jié)構(gòu)、溶劑系統(tǒng)物質(zhì)組成與比例、pH值、選用濾紙質(zhì)地和溫度等因素都會(huì)影響Rf值。此外，樣品中的鹽分、其他雜質(zhì)以及點(diǎn)樣過多皆會(huì)影響樣品的有效分離。無色物質(zhì)的紙層析圖譜可用光譜法（紫外光照射）或顯色法鑒定。氨基酸紙層析圖譜常用的顯色劑為茚三酮或吲哚醍，本實(shí)驗(yàn)采用茚三酮為顯色劑。本實(shí)驗(yàn)用單向上行層析法作標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，用雙向上行紙層析法作幾種已知氨基酸的層析圖譜。然后將其中的谷氨酸和天冬氨酸加以定量測(cè)定。試劑和器材―、試劑（1） 8X10-3mol/L谷氨酸和8X10-3mol/L天冬氨酸混合液。（2） 谷氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、Y-氨基丁酸和丙氨酸混合液（已知氨基酸混合液）。將以上氨基酸分別配制成8X10-3mol/L的濃度，然后混合之。（3） 茚三酮重結(jié)晶方法：茚三酮有時(shí)由于包裝不好或放置不當(dāng)常帶微紅色，需重結(jié)晶方可使用。5g茚三酮溶于15mL熱水，加入0.25g活性炭輕輕攪動(dòng)，若溶液太濃不易操作，可酌量加5—10mL熱水，加熱30min后趁熱過濾（用熱濾漏斗，以免茚三酮遇冷結(jié)晶而損失），濾液置冰箱內(nèi)過夜，次日晨即見黃白色結(jié)晶出現(xiàn)，過濾，再以1mL冷水洗滌結(jié)晶，置于干燥器中干燥，最后裝入棕色瓶?jī)?nèi)保存。（4） 0.1%硫酸銅（CuSO4-5H2O）:75%乙醇=2:38硫酸銅難溶于乙醇，將硫酸銅直接用75%乙醇溶解不能得到澄清溶液，如將硫酸銅溶液和乙醇混合后，放置過久則會(huì)有沉淀析出，因此，必須在臨用前按比例混合。正丁醇（需重蒸），95%乙醇，88%甲酸，12%氨水（因氨易揮發(fā)，稀釋前需測(cè)出畢重）。0.5%茚三酮丙酮溶液。二、器材新華中速薄層析濾紙，層析缸（高約430mm，直徑約290mm，具有磨口蓋子），鼓風(fēng)恒溫箱，國(guó)產(chǎn)72型分光光度計(jì)，水浴鍋，噴霧器，電吹風(fēng)機(jī)，點(diǎn)樣架，點(diǎn)樣管，加溶劑的漏斗，針、線和尺子，橡皮（或線）手套，結(jié)晶皿。

操作方法操作方法一、濾紙的剪裁選用國(guó)產(chǎn)新華1號(hào)濾紙，剪裁成28cmX28cm，在濾紙上距相鄰的兩邊各2.0cm處用鉛筆輕輕劃兩條線，在線的交點(diǎn)上，點(diǎn)樣（圖1.1）o圖1.1濾紙的剪裁二、點(diǎn)樣已知氨基酸混合液點(diǎn)樣量30-40ML為宜。將準(zhǔn)備好的濾紙平放在干凈的玻璃板上。用定量點(diǎn)樣毛細(xì)管準(zhǔn)確吸取樣品到一某一刻度，與濾紙垂直方向輕輕碰點(diǎn)樣處，點(diǎn)子的擴(kuò)散直徑控制在0.5cm以內(nèi)。點(diǎn)樣過程中必須在第一點(diǎn)樣品干后再點(diǎn)第二滴。為使樣品加速干燥，可用電吹風(fēng)機(jī)吹干，注意溫度不宜過高，避免破壞氨基酸，影響定量結(jié)果。將點(diǎn)好樣品的濾紙兩側(cè)邊緣比齊，用線縫好，揉成筒狀（圖1.2）。注意縫線處紙的兩邊不能接觸，以免由于毛細(xì)管現(xiàn)象使溶劑沿兩邊移動(dòng)特別快而造成溶劑前沿不齊，影響Rf值。圖1.2 圖1.3層析濾紙圓筒層析濾紙圓筒三、展層將圓筒狀的濾紙放入結(jié)晶皿，注意濾紙不要與皿壁接觸，皿周圍放3個(gè)小燒杯，內(nèi)盛平衡溶劑，蓋好蓋子，平衡1h后打開蓋子少許，用移液管（管下端接觸到結(jié)晶皿底部）加入層析溶劑（展層劑），取出移液管時(shí)勿使它碰紙。當(dāng)溶劑展層至距離紙的上沿約1cm時(shí)取出濾紙，立即用鉛筆標(biāo)出溶劑前緣位置，用吹風(fēng)機(jī)涼風(fēng)吹干。進(jìn)行雙向?qū)游鰰r(shí)，先用一種溶劑展層后，晾干，將紙轉(zhuǎn)900角，再用另一溶劑展層。經(jīng)第一相展層后，上端未經(jīng)溶劑走過的濾紙（距紙邊約1cm）與已被溶劑走過的部分形成一條分界線，進(jìn)行第二相層析時(shí)，在分界線上影響斑點(diǎn)形狀，因此在第二相層析時(shí)，先將第一相上端截去約2cm除去液邊。在截去邊緣以前，需將原點(diǎn)至溶劑前沿的距離量好，并記錄下來。雙向?qū)游鋈軇┫到y(tǒng)：第I相，正丁醇：12%氨水：95%乙醇=13:3:3（體積比，層析2次），第II相，正丁醇：80%甲酸：水=15:3:2（體積比）。第I相展層用12%氨水作平衡溶劑，第II相展層時(shí)，用該相溶劑平衡。展層劑要新鮮配制并搖勻，每相用量18 20mL。四、定性鑒定把已經(jīng)除去溶劑的層析濾紙用25mL0.5%茚三酮丙酮溶液在紙的一面均勻噴霧，待自然晾干后，用鉛筆輕輕描出顯色斑點(diǎn)的形狀。用一直尺量度每一顯色斑點(diǎn)中心與原點(diǎn)之間的距離和原點(diǎn)到溶劑前沿的距離，求其比值，即得該氨基酸的Rf值。應(yīng)該注意的是，使用茚三酮顯色法，在整個(gè)層析操作中，避免用手接觸層析紙，因手上常有少量含氨物質(zhì)，在顯色時(shí)也得出紫色斑點(diǎn)，污染層析結(jié)果，因此，在操作過程中應(yīng)戴手套或指套。同時(shí)也要防止空氣中氨的污染。一種氨基酸在同樣條件下，其Rf值是一個(gè)常數(shù)，因此，將各顯色斑點(diǎn)的Rf值與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的Rf值比較，即可得知該斑點(diǎn)是哪一種氨基酸。對(duì)于雙相層析Rf值由兩個(gè)數(shù)值組成，即要在第I相計(jì)量一次和在第II相計(jì)量一次，分別與標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的Rf值對(duì)比，即可初步肯定其為何種氨基酸。參考表1.1的數(shù)據(jù)和圖1.5中的氨基酸斑點(diǎn)位置，對(duì)所得的層析結(jié)果加以辨認(rèn)，定性鑒定圖譜中1，2,3,4,5號(hào)斑點(diǎn)為何種氨基酸。圖1.5幾種已知氨基酸的雙向?qū)游鰣D譜表1.1氨基酸名稱第I相Rf值第II相Rf值1.天冬氨酸0.020.192.谷氨酸0.020.293.谷氨酰胺0.0800.1804.Y-氨基丁酸0.130.455.丙氨酸0.200.46注意事項(xiàng)（1） 選用合適、潔凈層析濾紙。如濾紙不干凈，可將濾紙浸于0.4mol/LHCL中20h,蒸餾水洗至中性，再依次用95%乙醇、無水乙醇及無水乙醚各浸洗一次。吹風(fēng)機(jī)吹去乙醚，400C烘干。（2） 點(diǎn)樣斑點(diǎn)不能太大（其直徑應(yīng)小于0.5cm），防止氨基酸斑點(diǎn)不必要的重疊，吹風(fēng)