上海市臨檢中心 PCR人員上崗培訓(xùn)班 課件6、分子病理檢測(cè)及其質(zhì)量控制-周曉燕

分子病理檢測(cè)及其質(zhì)量控制復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院病理科

周曉燕2016-03-22

上海腫瘤個(gè)體化診療快速發(fā)展分子設(shè)備及技術(shù)快速發(fā)展不斷發(fā)現(xiàn)診斷和治療的模型發(fā)生改變腫瘤診斷模式的改變Multi-step

dignosisSingle-step

diagnosis經(jīng)驗(yàn)證據(jù)，

主觀客觀形態(tài)分子，

定性定量分子病理主要應(yīng)用檢測(cè)組織、細(xì)胞中特征性的分子異常?分子診斷及分型化療有效性和毒副作用的預(yù)測(cè)?腫瘤易感性與遺傳性??腫瘤中的主要分子異常形式?染色體異?！?/p>

易位/倒轉(zhuǎn)/缺失/插入/重復(fù)???基因結(jié)構(gòu)異?！嘏?基因內(nèi)、外）/擴(kuò)增/突變/MSI基因表達(dá)異常——融合基因轉(zhuǎn)錄體，mRNA和蛋白過表達(dá)——DNA/——根據(jù)異常形式，選擇恰當(dāng)?shù)募夹g(shù)平臺(tái)分子病理診斷應(yīng)用于常見腫瘤?

淋巴瘤乳腺癌???????軟組織腫瘤肺癌黑色素瘤甲狀腺腫瘤腦腫瘤????..分子病理流程和基本技術(shù)平臺(tái)組織標(biāo)本準(zhǔn)備細(xì)胞切片選擇、病理質(zhì)控切片核酸提取ISH/FISH/SISHPCRbased檢測(cè)346主要內(nèi)容?

FISH檢測(cè)及其應(yīng)用?

PCR?

FISH及PCR相關(guān)檢測(cè)的質(zhì)量控制8主要內(nèi)容?

FISH檢測(cè)及其應(yīng)用??

分子檢測(cè)中的質(zhì)量保證和質(zhì)量控制9FISH檢測(cè)的原理直接：探針直接標(biāo)記熒光素

間接：探針標(biāo)記生物素/地高辛-間接抗XXX熒光素?zé)晒怙@微鏡下觀察FISH檢測(cè)的主要應(yīng)用ò基因擴(kuò)增òò基因缺失FISH法檢測(cè)Her-2基因擴(kuò)增ò乳胃腺癌癌：：25%-30%ò10%-30%乳腺癌Her-2/neu基因狀態(tài)的意義ò

預(yù)后因子：無論淋巴結(jié)狀態(tài)如何ò

預(yù)測(cè)因子：內(nèi)分泌治療HER2陽性患者相對(duì)耐藥C紫M杉F類方

藥案

物H相E對(duì)R敏2陽感性患者相對(duì)耐藥蒽環(huán)類對(duì)大劑量蒽環(huán)類相對(duì)敏感ò

靶向治療靶點(diǎn)：Her-2狀態(tài)指導(dǎo)靶向治療2013HER2

ISH判斷流程及主要更新點(diǎn)雙探針：比值的閾值改變HER2拷貝數(shù)結(jié)合閾值和拷貝數(shù)兩個(gè)參數(shù)單探針2013HER2

ISH判斷流程及主要更新點(diǎn)陽性

由

>6≥6≥4,<

6不確定

由4-6陰性

<4不變胃癌中HER2狀態(tài)及其臨床價(jià)值ò胃食管交界處和胃曲妥珠單抗治療顯著延長生存期òòòò進(jìn)展期胃癌靶向治療患者篩選、療效預(yù)測(cè)依據(jù)胃癌HER2檢測(cè)指南(2011版)胃癌的HER2檢測(cè)流程IHC陰性不確定陽性0/1+2+3+報(bào)告為報(bào)告為HER2陰性HER2陽性ISH不適合治療適合治療FISH/(D)SISH/CISHFISH檢測(cè)的重要環(huán)節(jié)?方法選擇：FISH/CISH/SISH？單探針/雙探針??蠟塊選擇：活檢/手術(shù)？冰凍/石蠟？原發(fā)/轉(zhuǎn)移？?檢測(cè)過程：切片-脫蠟-水化-消化-雜交-洗滌-封片（手工、全自動(dòng)）?結(jié)果判讀：質(zhì)量、區(qū)域、計(jì)數(shù)、結(jié)果報(bào)告及其解釋計(jì)數(shù)細(xì)胞核選擇大小一致；胞核邊界完整；DAPI染色均一；細(xì)胞核無重疊；至少20個(gè)癌細(xì)胞核中的雙色信號(hào)CEPl7綠色信號(hào)清晰

；融合或簇狀信號(hào)數(shù)估計(jì)胃癌中HER2陽性特點(diǎn)ò與組織學(xué)類型相關(guān)：腸型、混合型、彌漫型ò與腫瘤部位相關(guān)：胃食管交界處、胃中2+的病例比例可能高òIHC

ISH

——30%ò

IHCò與標(biāo)本類型有關(guān)：

手術(shù)標(biāo)本>活檢òIHC和FISH不一致更多見，IHC陰性：報(bào)道7.5%ISH陽性FISH在檢測(cè)染色體易位中的應(yīng)用?基礎(chǔ)：

非隨機(jī)性染色體異常，與類型有關(guān)應(yīng)用：

診斷、分型、靶向治療??腫瘤：淋巴瘤、軟組織腫瘤、肺癌、甲狀腺腫瘤易位的模式圖9號(hào)染色體22號(hào)染色體檢測(cè)易位的探針類型?

融合探針?

分離探針淋巴瘤中的頻發(fā)特異染色體異常淋巴瘤類型非隨機(jī)染色體異常涉及基因CLL/SLLDel

13q14unknownTrisomy

12unknownDel

11q22-23ATMDel

17p13TP53LPLt

(9:14)

(p13;q32)PAX-5/IGHMALT-MZLFLt(11;18)(q21;q21)t(14;18)(q32;q21)CIAP2/MLTIGH/MALT1t(14;18)

(q32;q31)BCL-2/IGHMCLt(11;14)(q13;q32)cyclinD1/IGHDLBCLBLt(3q27)BCL6t(14;18)(q32;q21)BCL-2/IGHt(8;14)(q24;q32)myc/IGHt(2;8)(p11;q24)IGLK/myct(8;22)(q24;q11)myc/IGLLALCLt(2;5)

(p23;q35)等ALK/NPMMCL分子遺傳學(xué)特征ò特征性

t（11；14）

（BCL1-IGH）

95%，

少數(shù)：

IGK，IGLt

(11;14)

+t

(11;14)

-61M，

（十二指腸球部、升結(jié)腸、橫結(jié)腸）活檢組織小而破碎IGH/CCND1Dual

Color,DualFusion

Translocation

Probe軟組腫瘤織類型腫瘤中的頻發(fā)特異染色體異常Synovial

sarcomaEwing's

sarcoma/Primitive–––––––––neuroectodermal

tumorClear-cell

sarcoma–Extraskeletal

myxoid

chondrosarcomaDesmoplastic

small

round

cell

tumor–Myxoid/round

cell

liposarcoma–––Alveolar

rhabdomyosarcoma–Dermatofibrosarcoma

protuberans–Congenital

fibrosarcoma––Alveolar

soft

part

sarcoma––Inflammatory

myofibroblastic

tumorLow-grade

fibromyxoid

sarcoma––具有EWSR1相關(guān)易位的腫瘤類型Clear

cellsarcomaETS

familyFLI1

11q24ERG21q22ETV17p22ETV417q12ZSG

22q12Ewing

Sarcoma/PNETATF1

12q13CREB12q32AngiomatoidfibroushistiocytomaEWSR122q12DesmoplasticsmallroundcelltumorExtraskeletalmyxoidchodrosarcomaNR4A39q32WT111p13病例：

59M

腋下腫塊，足部具有黑色素分化腫瘤病史軟組織透明細(xì)胞癌主要內(nèi)容?

FISH檢測(cè)及其應(yīng)用??

分子檢測(cè)中的質(zhì)量保證和質(zhì)量控制32PCR及分析技術(shù)?PCR-凝膠電泳：特異性片段、片段大小?PCR-毛細(xì)管電泳：序列分析、片段長度分析：多基因突變、表達(dá)等?

PCRmRNA?NGS?

其他相關(guān)技術(shù)：DHPLC，

PCR-SSCP。。。。。PCR-凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯凝膠電泳PCR法檢測(cè)淋巴瘤中克隆性重排ò不確

同定

的惡

淋性

巴克

細(xì)隆

胞的

，存

相在

同，

的是

重淋

排巴

形瘤

式診

，斷

淋和

巴鑒

細(xì)別

胞診

單斷

克的

隆分

性子

增指

生標(biāo)ò應(yīng)用：

診斷與鑒別診斷；譜系確定；ò分期

外周血、骨髓累及克隆相關(guān)性判斷,PCR法---最常用的克隆性重排的檢測(cè)方法1.

聚丙烯凝膠電泳法分析2.基因掃描分析66M,

胃黏膜活檢43F,

左腮腺腫塊明顯的漿樣分化細(xì)胞胃黏膜活檢標(biāo)本：

FR1(+),FR2(+),

FR3(+)診斷：

（胃）小B細(xì)胞淋巴瘤，傾向MALT邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤左腮腺腫塊：FR1

(+),FR2(+),

FR3(-)診斷：（左腮腺）符合MALT邊緣區(qū)B細(xì)胞淋巴瘤毛細(xì)管電泳基因掃描（genescanning）ò

敏感òòò快速分辨率高可獲得更多信息——具有優(yōu)勢(shì)PCR-毛細(xì)管電泳的應(yīng)用——片段分析（基因掃描）、突變分析手術(shù)標(biāo)本活檢標(biāo)本胸水等細(xì)胞基因掃描圖測(cè)序分析圖譜DNA

抽提**PCR是關(guān)鍵：產(chǎn)物長度--------特異性建議通用測(cè)序引物PCR

擴(kuò)增必要時(shí)巢式遺傳分析儀PCR產(chǎn)物電泳PCR產(chǎn)物純化R基因掃描在克隆性重排分析中的應(yīng)用單克隆性細(xì)胞產(chǎn)生一個(gè)或兩個(gè)尖的峰，多克隆為多個(gè)小峰，呈分布。陰性對(duì)照78F,

胃竇、胃底活檢組織，

組織較小，

CD20+、CD79+、bcl6+、κ+、結(jié)合形態(tài)、IHC

和基因重排檢測(cè)診斷為DLBCLKi67

95%等MSI及MMR檢測(cè)的臨床價(jià)值ò

遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌

(HNPCC)篩選：若IHC-MLH1蛋白缺失，還需檢測(cè)BRAF突變————有結(jié)直腸癌家族史的患者應(yīng)做MMR或MSI檢測(cè)。ò推薦II期病人應(yīng)行MMR檢查：——分不

化會(huì)

差從

的

病

理輔類助型治如療果中伴獲有益M。SI-H則不認(rèn)為是高危因素——II——期病人伴有MSI-H時(shí)預(yù)后好5-FUò

PD-1抑制劑是否獲益的指標(biāo)43MSI

分析ò檢測(cè)方法

單核苷酸重復(fù)個(gè)單；或更多NCI:

Bethesda

consensus

panel:2個(gè)單、3個(gè)雙；分Pr別o

m對(duì)e同g

a一:病例的正常和腫pa瘤n

e組l:織5進(jìn)行顯微切割、核酸提取擴(kuò)增后作毛細(xì)管電泳分析；ò

判個(gè)斷不方穩(wěn)法定：2沒有不穩(wěn)定個(gè)及以上不穩(wěn)定——MSI-H1——MSI-L——MSS，或不確定MSI分析方法PCR-毛細(xì)管電泳圖抽提正常和腫瘤組織

DNA提取

PCR反應(yīng)毛細(xì)管電泳結(jié)果分析68F直腸腺癌，

T4N0M0MSSD5S346D17S250D2S123Bat26Bat2573M，

左半結(jié)腸腺癌，T3N0M0，

MSI-HD17S250D2S123D5S346Bat26Bat25PCR-直接測(cè)序的應(yīng)用ò點(diǎn)突變、小片段缺失、插入的檢測(cè)ò應(yīng)用：胃腸道間質(zhì)瘤中KIT和PDGFRA基因突變結(jié)直腸癌中KRAS、NRAS和BRAF基因狀態(tài)突變肺癌中EGFR、KRAS、ALK基因異常等等。胃腸道間質(zhì)瘤中KIT和PDGFRA突變ò

功能獲得性KIT突變：大多數(shù)-CD117陽性細(xì)胞表面酪氨酸激酶持續(xù)性活化，細(xì)胞ò

PDGFR突變：少部分增殖失控——PDGFR:Exon12,

14，18KIT:

Exon9,11,

13,17GIST中

KIT

和

PDGFRA

突變KITPDGFR

總突變率A:

87.4%外顯子

9

(11%)細(xì)胞膜外顯子

11

(67.5%)外顯子

12

(0.9%)外顯子

13

(0.9%)外顯子

14

(0.3%)細(xì)胞質(zhì)外顯子

17

(0.5%)外顯子

18

(6.3%)GIST中分子病理應(yīng)用協(xié)助診斷?

對(duì)疑難病例應(yīng)進(jìn)行c-kit或PDGFRA突變分析以及兒童GIST,

鑒別同時(shí)性和原發(fā)性GIST?GIST鑒別NF1型GIST、完全或不完全Carney’s三聯(lián)癥、家族性?術(shù)原前發(fā)擬可用切分除子

靶

向手治術(shù)療后，中

高度復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，擬用伊馬替尼輔

?助治療所有初次診斷的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移性GIST，擬用分子靶向治療二次突變檢測(cè)?GIST-?繼發(fā)性耐藥需要重新檢測(cè)突變類型與靶向治療敏感性的關(guān)系突變位點(diǎn)對(duì)Imatinib的反應(yīng)KIT突變

Exon

11反應(yīng)最好Exon

9反應(yīng)中等Exon

13反應(yīng)差Exon

17反應(yīng)差PDGFRA

Exon

12反映敏感Exon

18D842V反應(yīng)差,其余敏感無突變反應(yīng)差繼發(fā)型突變對(duì)靶向治療抵抗220230240250260270280290300310AGGTGATCTATTTTTCCCTTTCTCCCCACAGAAACCCATGTATGAAGTAC------AGGTTGTTGAGGAGATAAATGGAAACAATTATGTTTACATAGACCCAAAGGTGATCTATTTTTCCCTTTCTCCCCACAGAAACCCATGTATGAAGTAC------AGGTTGTTGAGGAGATAAATGGAAACAATTATGTTTACATAGACCCAAAGGTGATCTATTTTTCCCTTTCTCCCCACAGAAACCCATGTATGAAGTACAG------GTTGTTGAGGAGATAAATGGAAACAATTATGTTTACATAGACCCAAAGGTGATCTATTTTTCCCTTTCTCCCCACAGAAACCCATGTATGAAGTACAGTGGAAGGTTGTTGAGGAGATAAATGGAAACAATTATGTTTACATAGACCCAACGGTGATCTATTTTTCCCTTTCTCCCCACAGAAACCCATGTATGAAGTAC------AGGTTGTTGAGGAGATAAATGGAAACAATTATGTTTACATAGACCCAACGGTGATCTATTTTTCCCTTTCTCCCCACAGAAACCCATGTATGAAGTAC------AGGTTGTTGAGGAGATAAATGGAAACAATTATGTTTACATAGACCCAA320330340350360370380390400410420CAACTTCCTTATGATCACAAATGGGAGTTtCCCAGAAACAGGCTGAGTTTTGGTCAGTATGAAACAGGGGCTTTCCATGTCAATGTCAATATGTTGGCTTTCGGCAACTTCCTTATGATCACAAATGGGAGTT-CCCAGAAACAGGCGAAGGC胃間質(zhì)瘤：第十一外顯子檢出6個(gè)堿基純合性缺失：c

1669-1674

delTGGAAG。該缺失可造成第557位密碼子色氨酸（Trp,

W）和558位密碼子賴氨酸（lys,

K）的缺失。一例小腸GIST中

KIT第9外顯子突變：

可見

c.1504-1509

dup

GCCTAT

（雜合性），導(dǎo)致p.502-503dup

AY。

（上圖為KIT基因第9外顯子野生型序列，下圖為該病例正向測(cè)序結(jié)果）結(jié)直腸腫瘤生成中RAS的作用EGFR

(HER1)EGFTGF-αRAS基因家族HB-EGFEpiregulin與是否EGFR抑制無關(guān)K-RAS:

E2,3,4RAS突變導(dǎo)致持續(xù)信號(hào)激活，H-RAS：RAFMEKERKN-RAS:

E2,3,41.

DeRoock,

etal.Lancet

Oncol

2010

2.3.

Fernández-Medarde,

Santos.

Genes

Cancer

2011;

4.De

Roock,

etal.Lancet

Oncol

2011PRIME研究中

RAS/RAF分析?

常見的KRAS外顯子2基因突變以外，其他RAS基因突變（KRAS外顯子和4，NRAS外顯子2、3和4）約占總腸癌人群的10%3

野生型患者相比于外顯子

野生型患者，帕妥木單抗聯(lián)合的中位PFS從9.6月提高到10.1月，中位OS從23.9月提高到26?

R月A（S有顯著差異），而化KR療A組S沒有改2變。FOLFOXDouillardJYetal.NEngl

JMed2013;369:1023-1034ó2015所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌都應(yīng)該做腫瘤組織的RAS突變檢測(cè)（KRAS+NRAS)，至少KRAS-E2，如有可能，檢測(cè)KRAS-E2+KRAS-non-E2+NRAS?與Erbitux療效及患者生存相關(guān)57RAS(KRAS+NRAS)

野生型預(yù)后更好KRASorNRASRAS突變是否是其他EGFR抗體預(yù)測(cè)指標(biāo)尚待進(jìn)一步研究Douillard

JY

et

al.

NEnglJMed

2013;369:1023-1034BRAF基因ò7q34，

18個(gè)外顯子組成，783個(gè)氨基酸編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶òòò由三個(gè)保守區(qū)組成CR1、CR2、CR3

（激酶區(qū)）是RAS-RAF-MEK-ERK上游調(diào)節(jié)因子更新：如RAS無突變，考慮BRAF突變檢測(cè)無論RAS狀態(tài)如何，均應(yīng)作BRAF突變檢測(cè)60BRAF基因突變位點(diǎn)?

80%：激酶功能域V600EBollag

G.NatRev

Cancer2007

Apr;7(4):295BRAF突變與結(jié)直腸癌的關(guān)系5%-9%ò與預(yù)臨后床差病理高危因素相關(guān)：近端、T4、低分化ò目前尚無證據(jù)證明其對(duì)靶向治療的指導(dǎo)作用ò突變提示：體細(xì)胞MLH1甲基化，而非胚系基因突變ò正向結(jié)腸腺癌中KRAS基因突變：KRAS

12codonGGT>GAT

,p.G12DReal-time

PCR技術(shù)?在PCR反應(yīng)體系中加入熒光探針；?實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程；?定量和定性分析熒光探針非特異性熒光標(biāo)記：1、SYBR

Green特異性熒光標(biāo)記：1、TaqMan2、環(huán)蝎

形形

探探

針針3.TaqMan---水解型雜交探針與目標(biāo)序列互補(bǔ)?

5′端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter,

R)

，如FAM、VIC等?

3′端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)

(Quencher,

Q)?

探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收，無熒光，R與Q分開，發(fā)熒光?

Taq酶有

5′→3′外切核酸酶活性，可水解探針TaqMan法工作原理每擴(kuò)增一條DNA分子，釋放一個(gè)熒光信號(hào)，可以在循環(huán)過程中任一點(diǎn)檢測(cè)熒光ARMS法檢測(cè)突變ARMS：amplification

refractory

mutation

system等位基因特異性PCR

+熒光探針=

ARMS方法突變正向引物延伸反向引物產(chǎn)生熒光信號(hào)ADNA突變正向引物無延伸反向引物野生DNA模板GReal-time

PCR技術(shù)的應(yīng)用ò突變/SNP分析：ARMS、HRM等òRNA

:ARMS結(jié)果判讀判讀依據(jù)：ò陰性對(duì)照；G719Xòòò陽性對(duì)照；內(nèi)對(duì)照；計(jì)算S768Iò不同試劑盒有不同標(biāo)準(zhǔn)òCT或可自動(dòng)輸出NSCLC中驅(qū)動(dòng)基因異常NSCLC：

腫瘤驅(qū)動(dòng)基因及相應(yīng)靶向藥物驅(qū)動(dòng)基因檢測(cè)：靶向藥物選擇和臨床試驗(yàn)規(guī)范分子檢測(cè)：是規(guī)范治療的前提和保證òEGFRòKRASòALK

fusions

3-7%òHER2òBRAFòPIK3CAòAKT1òMAP2K1òNRAS廣州省人民醫(yī)院上海腫瘤醫(yī)院胸外科-非吸煙腺癌òROS1

fusionsòKIF5B-RETEGFR突變與臨床、病理NS主C要LC發(fā)生于ò腺癌和腺鱗癌：不吸煙、亞洲、女性常見ò

鱗癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌、粘液性癌：少見SCC臨床特征：不作為選擇分子檢測(cè)的依據(jù)組織學(xué)亞型：可作為分子檢測(cè)的篩選基礎(chǔ)推薦所有含腺癌成分的NSCLC進(jìn)行檢測(cè)小標(biāo)本鱗癌也建議檢測(cè)72EGFR基因TK區(qū)突變?nèi)愅蛔冃问剑酣翱蝈e(cuò)架義內(nèi)突缺變失：：Exon19

delòò插入突變：Exon2018-21òExon19、：2最1重：

要最

突常

變見一半為原發(fā)性耐藥òE一xo半n2為0

獲得性耐藥

-T790MCheng

L

et

al.Modern

Pathol2012;25:347-36973EGFR基因突變檢測(cè)方法任何檢測(cè)DNA

突變的方法采用PCRbased

技術(shù)，具有敏感性和特異性IHC檢測(cè)突變蛋白和FISH法檢測(cè)EGFR拷貝數(shù)——都不是作為TKI患者篩選的指標(biāo)！EGFR突變檢測(cè)方法列E出M3Q2N中數(shù)方據(jù)法我國PQCC數(shù)據(jù)測(cè)序和其他òSanger

DNA

sequencingò

ARMSò20%ò

HRMòNextGen

sequeningòTaqman,Cobas測(cè)序法與ARMS法比較測(cè)序法ARMS敏感度10-30%1%FFPE標(biāo)本成功率低高檢測(cè)流程復(fù)雜、長簡單快速數(shù)據(jù)分析要求高低突變類型已知和未知已知假陽性機(jī)會(huì)(交叉污染)多少假陰性機(jī)會(huì)多少儀器成本高低商用試劑盒無有試劑成本低高主要內(nèi)容?

FISH檢測(cè)及其應(yīng)用??

分子檢測(cè)中的質(zhì)量保證和質(zhì)量控制77質(zhì)量保證和質(zhì)量控制檢測(cè)前檢測(cè)中檢測(cè)后保證過程有效合理保證結(jié)果（質(zhì)Q量A保證）室間質(zhì)評(píng)室內(nèi)質(zhì)控準(zhǔn)確可靠（質(zhì)Q量C控制）標(biāo)本來源及形式手術(shù)標(biāo)本石蠟切片組織蠟塊FFPE細(xì)胞蠟塊4-5umctDNA/CTC是重要補(bǔ)充?手術(shù)標(biāo)本最理想；規(guī)范檢測(cè)很重要！??標(biāo)本質(zhì)量很關(guān)鍵；樣本類型和病理質(zhì)控ò

手術(shù)切除標(biāo)本——首選、最可靠重要來源細(xì)胞學(xué)標(biāo)本：ò活檢小標(biāo)本：穿刺細(xì)胞，脫落細(xì)胞

（胸水、支氣管刷取物、痰液等）ò——標(biāo)本來源、腫瘤及類型、腫瘤細(xì)胞比例、數(shù)量、DNA質(zhì)、量必要時(shí)顯微切割分子病理檢測(cè)中需注意的環(huán)節(jié)?組織前處理對(duì)分子檢測(cè)的影響判讀中的質(zhì)量檢查?消化時(shí)間對(duì)FISH檢測(cè)的影響??????檢測(cè)方法性能參數(shù)的確立?FISH判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定分子檢測(cè)中的病理質(zhì)控檢測(cè)中的各種對(duì)照設(shè)立多平臺(tái)建立、對(duì)照參加室間質(zhì)評(píng)81檢測(cè)前處理中主要環(huán)節(jié)組織消化提取ISH固定、切片PCRDNA/RNA固定目的

?學(xué)上離可體見后的組細(xì)織胞改器變變：

化活和體

細(xì)組

胞織組一

織旦

的停形止態(tài)血改供變，直物至質(zhì)自代溶謝。就會(huì)產(chǎn)生一系列的生物化學(xué)和組織化學(xué)改變，并導(dǎo)致形態(tài)

?免疫固化定學(xué)目成的分：應(yīng)用中性緩沖福爾馬林液，僅可能地保存良好的固定是切片、免疫組化、分子病理檢測(cè)成功的基礎(chǔ)組織細(xì)胞離體時(shí)具有的生理和病理形態(tài)結(jié)構(gòu)、生物化學(xué)、良好的固定?及時(shí)固定：EGFR/KRAS規(guī)范中：

離體20~30分鐘內(nèi)固定。HER-2規(guī)范中：離體1小時(shí)內(nèi)固定?固定液：10%

中性緩沖福爾馬林液，避免使用酸性及含有中金屬離子固定液處理標(biāo)本。固定液的量應(yīng)為組織的10倍。?固定時(shí)間：EGFR/KRAS檢測(cè)規(guī)范中活檢標(biāo)本：6-12小時(shí)手術(shù)切除標(biāo)本：6-48小時(shí)HER-2

ISH檢測(cè)規(guī)范中：

6-72小時(shí)組織脫水和包埋?

充分脫水?

石蠟熔點(diǎn)應(yīng)低于60oC,

避免長時(shí)間置于融?

使用新鮮石蠟，并定期更換；切片、脫蠟?切片厚度：

ISH——

4-5um；同一實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一脫蠟：徹底，不徹底會(huì)影響監(jiān)測(cè)結(jié)果PCR——常規(guī)或厚切片?——保證脫蠟時(shí)間，定期更換二甲苯和酒精HER2-FISH操作過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)固定？切片厚度？福爾馬林固定,石蠟包埋組織切片標(biāo)本脫蠟至水蛋白酶消化FISH探針雜交洗脫消化濃度、PH值？時(shí)間雜交時(shí)間和溫度？洗脫時(shí)間和溫度？封片熒光顯微鏡下觀察87結(jié)果判斷前的質(zhì)量檢查?

不太接厚受，病細(xì)例胞：重疊???無腫瘤細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞不足細(xì)胞核不完整：細(xì)胞核邊界不清，或細(xì)胞核內(nèi)空洞，過渡消化有信號(hào)細(xì)胞<75%?

非特異染色???一旦發(fā)現(xiàn)染色結(jié)果未達(dá)到要求，則不能判讀，必需重新制片和染色良好的前處理陰性陰性，多倍體不良前處理對(duì)FISH檢測(cè)的影響本院：周五或周四標(biāo)本為多，尤其是小標(biāo)本（乳腺空芯針、肺活檢、穿刺細(xì)胞塊——固定時(shí)間長對(duì)分子病理檢測(cè)影響很大確定標(biāo)本類型、腫瘤特征分布乳腺癌胃癌計(jì)數(shù)區(qū)域選擇胃癌的兩個(gè)區(qū)域良好的前處理IGH-AIGH-BIGH-CIGK-AIGK-B陰性對(duì)照不良前處理對(duì)基因重排檢測(cè)的影響?內(nèi)對(duì)照僅顯示

100bp~200bp,

DNA降解?DNA量低，峰低?各管或某些管無擴(kuò)增，無法判斷。本院：周五或周四標(biāo)本為多——固定時(shí)間長是影響質(zhì)量的重要因素DNA質(zhì)量對(duì)基因重排檢測(cè)的影響內(nèi)對(duì)照300bp，F(xiàn)OXL2測(cè)序成功；內(nèi)對(duì)照200bp弱，F(xiàn)OXL2測(cè)序均不成功PCR檢測(cè)中“無基因、無核酸”措施ò實(shí)驗(yàn)室分區(qū):ò切片：切片和水的更換òDNA提取及操作：ò

桌面及產(chǎn)物處理：室內(nèi)質(zhì)控內(nèi)容監(jiān)控本次操作全過程、確保項(xiàng)目穩(wěn)定可靠病理質(zhì)控每次DNA質(zhì)量評(píng)估每次òòò對(duì)照設(shè)立：每次陰性、弱陽性（和/或陽性）對(duì)照不同方法的比對(duì)每年一次，至少20例òòòò不同檢測(cè)人員的比對(duì)定期，每次5例定期抽查病例符合率每月一次定期重復(fù)性檢測(cè)每月一次òò目的：防止假陽性和假陰性，保證結(jié)果準(zhǔn)確、可靠石蠟標(biāo)本核酸質(zhì)量檢查?DNA定量：nanodrop,

Qubit,QPCR?DNA純度

：OD值?DNA完整性——是影響結(jié)果的重要因素對(duì)照設(shè)立?

陰性對(duì)照：是否污染？是否有非特異？檢測(cè)能力？?

陽性對(duì)照：檢測(cè)能力？?:?

內(nèi)部對(duì)照：同一組織內(nèi)正常細(xì)胞的反應(yīng)DNA片段長度的檢測(cè)，降解程度？任何對(duì)照有問題都需要重新檢測(cè)，99重視病理診斷與病理評(píng)估?腫瘤組織學(xué)診斷是基礎(chǔ)，不可替代；?基于組織的分子診斷，病理評(píng)估不可缺少；——分子病理為個(gè)體化治療提供更多信息。病理質(zhì)控?

標(biāo)本類型病理類型???病變部位細(xì)胞百分比和細(xì)胞量——與結(jié)果密切有關(guān)101病理質(zhì)控流程組織標(biāo)本接收組織處理、蠟塊和H&E染色切片制作蠟塊未染色切片H&E染色切片去除標(biāo)記以外的區(qū)域病理質(zhì)量控制和顯微切割質(zhì)