CRISPR基因編輯技術(shù)演示文稿

CRISPR基因編輯技術(shù)演示文稿目前一頁\總數(shù)三十二頁\編于十一點(diǎn)CRISPR基因編輯技術(shù)目前二頁\總數(shù)三十二頁\編于十一點(diǎn)自從證明DNA是遺傳物質(zhì)以后，人類就開始了通過改變DNA來改造生物體生理機(jī)理和功能的嘗試。1973年，斯坦利·N·科恩(StanleyN.Cohen)和赫伯特·W·博耶(HerbertW.Boyer)成功將蛙的DNA插入到細(xì)菌中。20世紀(jì)70年代，基因泰克(Genetech)公司對大腸桿菌進(jìn)行基因改造，使其帶有一個(gè)人源基因(這個(gè)基因是人工合成的)，最后生產(chǎn)出治療糖尿病的胰島素。

1974年，，加利福尼亞州索克生物研究所(SalkInstituteforBiologicalStudies)的RudolfJaenisch通過將SV40病毒的DNA注射到小鼠的囊胚中,培育出了第一只轉(zhuǎn)基因小鼠。目前三頁\總數(shù)三十二頁\編于十一點(diǎn)基因突變技術(shù)：物理誘變、化學(xué)誘變…轉(zhuǎn)基因技術(shù)：T-DNA插入RNA干擾技術(shù)：dsRNA、ArtificialmiRNA核外遺傳技術(shù)：質(zhì)粒、人工染色體同源重組技術(shù)：e.g.傳統(tǒng)的基因敲除小鼠無法控制突變位點(diǎn)不能精確控制外源基因插入位點(diǎn)對靶基因抑制不徹底、不特異難以穩(wěn)定的遺傳費(fèi)時(shí)費(fèi)力費(fèi)錢，難以大量應(yīng)用并引起一系列生物倫理的問題…現(xiàn)狀目前四頁\總數(shù)三十二頁\編于十一點(diǎn)目前五頁\總數(shù)三十二頁\編于十一點(diǎn)基因組編輯技術(shù)基因組編輯技術(shù)（genomeediting）是一種可以在基因組水平上對DNA序列進(jìn)行改造的遺傳操作技術(shù)。也稱為基因打靶（Genetargeting）。技術(shù)的原理是構(gòu)建一個(gè)人工內(nèi)切酶，在預(yù)定的基因組位置切斷DNA，切斷的DNA在被細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)過程中會產(chǎn)生突變，從而達(dá)到定點(diǎn)改造基因組的目的。目前六頁\總數(shù)三十二頁\編于十一點(diǎn)歷史1993年前ZFN就已開始出現(xiàn)，迄今已發(fā)展了20多年才有今天的成就；2009年底出現(xiàn)的TALEN似乎一夜之間呈現(xiàn)出取代ZFN的架勢；2012年底CRISPR/Cas已顯現(xiàn)出取代TALEN的巨大潛力，在2013年成為現(xiàn)實(shí)。榮譽(yù)2011年：ZFN，TALEN和Meganuclease—2011年度方法（NatureMethods）2012年：TALEN—2012年十大突破（Science）2013年：CRISPR/Cas被認(rèn)為是諾貝爾獎級別的成果，華人科學(xué)家張峰已因此獲得生物醫(yī)學(xué)大獎?；蚪M編輯技術(shù)應(yīng)用基因組巡航導(dǎo)彈，分子剪刀，DNA外科醫(yī)生定點(diǎn)突變，定點(diǎn)修飾（包括得到轉(zhuǎn)基因），轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因治療（如遺傳?。┠壳捌唔揬總數(shù)三十二頁\編于十一點(diǎn)基因編輯的三大利器ZFN

(Zinc-fingernucleases,ZFN)TALEN（transcriptionactivator-likeeffectornucleases)CRISPR/Cas(clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeat/Cas-basedRNA-guidedDNAendonucleases）特異性DNA識別域非特異性核酸內(nèi)切酶+目前八頁\總數(shù)三十二頁\編于十一點(diǎn)9ZFN原理ZFN=蛋白的DNA識別域+核酸內(nèi)切酶DNA識別域：由一系列Cys2-His2鋅指蛋白（zinc-fingers）串聯(lián)組成（一般3~4個(gè)），每個(gè)鋅指蛋白識別并結(jié)合一個(gè)特異的三聯(lián)體堿基。目前九頁\總數(shù)三十二頁\編于十一點(diǎn)10核酸內(nèi)切酶：非特異性核酸內(nèi)切酶FokI，形成二聚體時(shí)切割雙鏈DNA

兩條ZFN之間具有被稱為“間隔區(qū)”的spacer結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)的長度以5～6bp為宜，7bp也能正常工作，合理的“間隔區(qū)”設(shè)計(jì)才能保證ZFN二聚體擁有最佳的工作空間。目前十頁\總數(shù)三十二頁\編于十一點(diǎn)ZFN技術(shù)的缺陷DNA識別域雖然具有較強(qiáng)的特異性識別能力，但是其識別的序列長度比較有限。因?yàn)閆FN剪切的過程不完全依賴同源二聚體的形成，所以一旦形成異源二聚體，就很可能造成脫靶效應(yīng)；如果出現(xiàn)脫靶，可能導(dǎo)致DNA的錯(cuò)配和序列改變，產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞毒性。當(dāng)這些不良影響積累過多，超過細(xì)胞修復(fù)機(jī)制承受的范圍時(shí)，便會引起細(xì)胞的凋亡。另一方面，該手段在細(xì)胞內(nèi)部操作的精確程度不足，則可能會引起相關(guān)基因突變，引發(fā)癌癥等。ZFN作為基因治療的手段之一，如果在生物體內(nèi)使用，可能會引發(fā)免疫反應(yīng)。而現(xiàn)有的研究手段尚不能預(yù)測引入的ZNF蛋白是否會引起免疫系統(tǒng)的進(jìn)攻。到目前為止，ZFN技術(shù)只能用于體外操作（invitro），在對人體提取的細(xì)胞進(jìn)行處理之后，再導(dǎo)入回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)。目前十一頁\總數(shù)三十二頁\編于十一點(diǎn)TALENTALEN（Transcriptionactivator-likeeffectors）:一種源于植物致病菌的靶向基因操作技術(shù)?？茖W(xué)家發(fā)現(xiàn)，來自植物細(xì)菌Xanthomonassp.(黃單胞菌)的TAL蛋白的核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點(diǎn)的核酸序列有恒定的對應(yīng)關(guān)系,一個(gè)模塊單元識別一個(gè)堿基，簡單且特異性極好。通過組合各類模塊，可對任意核苷酸序列進(jìn)行靶向特異性敲除或內(nèi)源基因的表達(dá)調(diào)控。目前已在人、大鼠、小鼠、豬、羊、斑馬魚、擬南芥及酵母等多類物種中得到成功應(yīng)用。目前十二頁\總數(shù)三十二頁\編于十一點(diǎn)TALEN原理典型的TALEN由一個(gè)包含核定位信號（NLS）的N端結(jié)構(gòu)域、一個(gè)包含可識別特定DNA序列的典型串聯(lián)TALE重復(fù)序列的中央結(jié)構(gòu)域，以及一個(gè)具有FokI核酸內(nèi)切酶功能的C端結(jié)構(gòu)域組成。DNA識別域：由一系列TAL蛋白串聯(lián)組成（一般20個(gè)左右），每個(gè)TAL蛋白識別并結(jié)合一個(gè)對應(yīng)的堿基。核酸內(nèi)切酶：非特異性核酸內(nèi)切酶FokI，形成二聚體時(shí)切割雙鏈DNA目前十三頁\總數(shù)三十二頁\編于十一點(diǎn)全長為34aa的Tal蛋白的第12、13位氨基殘基可以特異性識別核苷酸堿基。NG可以識別THD可以識別CNI可以識別ANN可以識別G或A通過這種特異性識別，將多個(gè)Tal蛋白組裝在一起，就可以構(gòu)成可以識別目的片段的Tale蛋白。TALEN原理目前十四頁\總數(shù)三十二頁\編于十一點(diǎn)TALEN的特異性打靶的原理：一對可以特異性識別靶基因的TALE，定位到需要編輯的基因組區(qū)域；然后非特異性核酸內(nèi)切酶FokI切斷雙鏈DNA從而造成DNA雙鏈斷裂（double-strandbreak，DSB）；再通過DNA的自我修復(fù)，引起堿基的缺失或突變，從而引起基因突變。FokI只有在形成二聚體的時(shí)候才有內(nèi)切酶活性。TALEN原理目前十五頁\總數(shù)三十二頁\編于十一點(diǎn)TALEN介導(dǎo)的基因編輯TALEN質(zhì)粒對共轉(zhuǎn)入細(xì)胞后，表達(dá)兩個(gè)融合蛋白，分別與靶位點(diǎn)特異結(jié)合，由于兩個(gè)TALEN融合蛋白中的FokI臨近，形成二聚體，發(fā)揮非特異性內(nèi)切酶活性，在兩個(gè)靶位點(diǎn)之間剪切DNA。形成DSB時(shí)，同源重組可將需要敲入的序列組合入基因組。目前十六頁\總數(shù)三十二頁\編于十一點(diǎn)TALEN的技術(shù)特點(diǎn)任意敲除，無基因序列、細(xì)胞、物種限制，永久失活成功率高，在保證轉(zhuǎn)染效率的前提下，有效性可達(dá)95%以上打靶效率高，可完全替代RNAi技術(shù)脫靶率低，尚未發(fā)現(xiàn)明顯脫靶效應(yīng)技術(shù)簡單，只需按照常規(guī)構(gòu)建質(zhì)粒方法構(gòu)建Talen質(zhì)粒目前十七頁\總數(shù)三十二頁\編于十一點(diǎn)CRISPR/Cas9背景CRISPR是生命進(jìn)化歷史上，細(xì)菌和病毒進(jìn)行斗爭產(chǎn)生的免疫武器，簡單說就是病毒能把自己的基因整合到細(xì)菌內(nèi)，利用細(xì)菌的細(xì)胞工具為自己的基因復(fù)制服務(wù)，細(xì)菌為了將病毒的外來入侵基因清除，進(jìn)化出很多成簇的、規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列(既CRISPR序列)和CRISPR相關(guān)基因，這一序列首先由日本學(xué)者于1987年首次發(fā)現(xiàn)(1)，于2002年被Jansen等將正式命名(。目前十八頁\總數(shù)三十二頁\編于十一點(diǎn)

CRISPR-Cas系統(tǒng)簡介

CRISPR-Cas系統(tǒng)的研究歷史1987年，日本課題組在K12大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復(fù)序列，隨后發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中。2002年，正式將其命名為成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列2005年發(fā)現(xiàn)CRISPR的間隔序列(spacer)與宿主菌的染色體外的遺傳物質(zhì)高度同源，推測細(xì)菌可能通過CRISPR系統(tǒng)可能以類似于真核生物的RNAi方式抵抗外源遺傳物質(zhì)的入侵。2007年，Barrangou等首次發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可能利用CRSPR系統(tǒng)抵抗噬菌體入侵；2008年，Marraffini等發(fā)現(xiàn)細(xì)菌CRISPR系統(tǒng)能阻止外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，首次利用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CRISPR系統(tǒng)的功能2013年初，MIT的研究組首次利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對人293T細(xì)胞EMX1

和PVALB基因以及小鼠Nero2A細(xì)胞Th基因?qū)崿F(xiàn)了定點(diǎn)突變。同年Mali利用CRISPR/Cas9在人293T細(xì)胞和K652細(xì)胞基因的靶位點(diǎn)形成雙鏈或單鏈的切口，從而激活細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)制高效介導(dǎo)外源基因定點(diǎn)插入。目前十九頁\總數(shù)三十二頁\編于十一點(diǎn)由這些序列和基因組成的系統(tǒng)我們稱之為CRISPR/Cas系統(tǒng)，而在這個(gè)系統(tǒng)中常用到的核酸內(nèi)切酶為Cas9,所以通常稱該系統(tǒng)CRISPR/Cas9系統(tǒng)。利用這個(gè)系統(tǒng)，細(xì)菌可以不動聲色地把病毒基因從自己的染色體上切除，這是細(xì)菌特有的免疫系統(tǒng)。CRISPR/Cas9背景目前二十頁\總數(shù)三十二頁\編于十一點(diǎn)CRISPR/Cas9概述CRISPR-Cas：一種來源是細(xì)菌獲得性免疫的由RNA指導(dǎo)Cas蛋白對靶向基因進(jìn)行修飾的技術(shù)。目前二十一頁\總數(shù)三十二頁\編于十一點(diǎn)

CRISPR-Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)CRISPR-CAS系統(tǒng)的組成主要包括:由不連續(xù)的重復(fù)序列R(repeat)與長度相似的間區(qū)序列S(spacers)間隔排列而成的CRISPR簇，前導(dǎo)序列L(leader)以及一系列CRISPR相關(guān)蛋白基因cas。

Cas蛋白是一種雙鏈DNA核酸酶，能在guideRNA引導(dǎo)下對靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。它與folk酶功能類似，但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。目前二十二頁\總數(shù)三十二頁\編于十一點(diǎn)CRISPR/Cas系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)識別作用切割作用CRISPR系統(tǒng)通常包括：由不連續(xù)的重復(fù)序列（repeats，R）與長度相似的間區(qū)序列（spacers，S）間隔排列而成的CRISPR簇，前導(dǎo)序列(leader，L)以及一系列的CRISPR相關(guān)蛋白基因(cas)。Cas（CRISPRassociated）：存在于CRISPR位點(diǎn)附近，是一種雙鏈DNA核酸酶，能在guideRNA引導(dǎo)下對靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。它不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。目前二十三頁\總數(shù)三十二頁\編于十一點(diǎn)CRISPR的轉(zhuǎn)錄與加工CRISPR簇首先轉(zhuǎn)錄成長的轉(zhuǎn)錄體，即（crRNA），然后逐步被加工成小的crRNA。目前二十四頁\總數(shù)三十二頁\編于十一點(diǎn)CRISPR/Cas9作用機(jī)理目前二十五頁\總數(shù)三十二頁\編于十一點(diǎn)CRISPR/Cas9作用機(jī)理PAM（NGG序列）目前二十六頁\總數(shù)三十二頁\編于十一點(diǎn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)靶向要求最主要的要求：PAM（protospacer-adjacentmotif）為NGG。在人類基因組中，平均每8bp就出現(xiàn)一個(gè)NGGPAM。目前二十七頁\總數(shù)三十二頁\編于十一點(diǎn)CRISPR/Cas9基因編輯實(shí)驗(yàn)流程圖目前二十八頁\總數(shù)三十二頁\編于十一點(diǎn)CRISPR/Cas9的技術(shù)應(yīng)用應(yīng)用于基因的敲除、敲入以及基因沉默、激活等。能夠在真核細(xì)胞中發(fā)揮作用，使真核基因組中的特異性位點(diǎn)發(fā)生雙鏈斷裂。在模式生物中的應(yīng)用:成功地對線蟲(左)、斑馬魚胚胎（中）和果蠅進(jìn)行遺傳學(xué)改造，獲得更粗短的線蟲，腹部組織體積更大的斑馬魚胚胎，和眼睛顏色更深的果蠅，表明CR