農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化

DNACaCl2處理而誘導(dǎo)CaCl2溶液中，0℃下處理便會使細(xì)菌細(xì)胞膜溫冰柜，分光光度計，接種針，10ml50ml1.5ml二、材料：土壤農(nóng)桿菌LBA4404菌株或其它農(nóng)桿菌菌株20mMCaCl2，高壓滅菌。1LBA44043mlYEB（Rif50mg/l）培養(yǎng)至OD600為0.5；內(nèi)使用，或液氮中速凍在低溫下，外源DNA（質(zhì)粒）可吸附到感受態(tài)細(xì)胞表面，誘導(dǎo)細(xì)胞吸收DNA。（加入熱激原理）轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒DNA的農(nóng)桿菌隨后28℃恢復(fù)培養(yǎng)，可使質(zhì)粒上攜帶的編碼抗生LBA4404（EHA105）pCAMBAI1300+SPRYEB（Kan抗性）YEB50℃時加入卡那霉素（Kan）和（Rif），至終濃度分別為100μg/ml和50μg/ml，混勻后立即倒入培養(yǎng)皿，凝固后4℃倒置保存。凍5min；50μg/mlRifYEB經(jīng)改造的Ti質(zhì)粒（只含有幫助T-DNA跳到植物上的Vir區(qū)）存在桿菌工程菌株中，含有T-DNA的雙元載體（BinoryVectors）完成重組后可以在大腸桿菌中擴增，提取質(zhì)粒DNA是基于DNA不質(zhì)粒DNA的變性不復(fù)性的差異而使其分離。當(dāng)細(xì)胞在NaOH和SDS溶液中裂解時，在pH高達(dá)12.6的堿性條件下，蛋白質(zhì)和DNA沖液時，質(zhì)粒DNA恢復(fù)原來的構(gòu)型，而DNA丌能復(fù)性，形成纏繞的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，DNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物隨細(xì)胞碎片等沉淀下來，質(zhì)粒DNA則留在上清MgSO4·7H2O0.5g，pH7.0，高壓滅菌。溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris-HCl10mmol/LEDTA（pH8.0），高壓滅菌（6.895×104Pa），4℃保存溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH，1％SDS0.4MNaOH（滅菌）2％SDS，用前等體積混合。溶液Ⅲ：3mol/LNaAc/KAc（pH4.8）10HAc11.5ml水乙醇、RNaseA挑取一個單菌落接種于3ml含相應(yīng)抗生素的YEB（50mg/LKm）液體培養(yǎng)基中，1.5ml1.5ml，10000rpm30sec（8）12000g10min400μl70%乙醇，12000g8min，（9）10μl20μg/mlRNaseATEDNA，37°C50-100v0.5-1hr)+煙草生根培養(yǎng)基：MS)+的升6-8min，無菌水沖洗5遍，無菌濾紙吸干水分6mm（5－從平板上挑取單菌落，接種到20mL附加相應(yīng)抗生素（卡那霉素）的YEB液體培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u，于28℃下以180r/min培養(yǎng)至OD600為0.6~0.8（約需17h）。OD6000.6~0.81%~2YEB右，待OD600為0.2~0.5時即可用于轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)2~4天。 點擊進入淘寶生物實驗，細(xì)胞、分子生物學(xué)、蛋白檢測技術(shù)實驗，約7G大小，22本套實驗制作耗資上百萬，由專業(yè)的影視和后期制作團隊拍攝+生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的教授專家指導(dǎo)+Thermo、Roche等著名企業(yè)參與共同制作完成。分子生物學(xué)實驗技術(shù)共6個，包括:DNA甲基化檢測、分子克隆技術(shù)、高分辨溶解曲線HRMQPCR位雜交（ISH。（ELISAblotting（IHC（ChIP細(xì)胞檢測技術(shù)共10個，