電泳和色譜分離技術(應用)

關于電泳和色譜分離技術(應用)第1頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月概述——過程特點第一節(jié)．電泳基本概念

1、電泳是指帶電荷的供試品(蛋白質、核甘酸等)在惰性支持介質中(如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等)在電場作用下向其對應的電極方向按各自的速度進行泳動，使組分分離成狹窄區(qū)帶，用適宜的檢測方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計算其百分含量的方法。電泳技術是實驗室中分析、鑒定和分離技術之一。第2頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月概述——過程特點第一節(jié)．電泳基本概念2、電泳分類：第3頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月概述——過程特點第二節(jié)電泳分離基本原理

帶電粒子在電場中產生定向遷移，引起其遷移所受力（F)與電場強度(E)和粒子所帶凈電荷（Z)成正比:粒子在電場中所受力與溶液黏度、分子半徑、及穩(wěn)態(tài)下移動速度有關第4頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月各種不同分子量的蛋白質在電場內遷移速率與它的凈電荷數成正比，而與其分子半徑及溶液黏度成反比。實驗證明，蛋白質的電泳遷移速率與蛋白質分子量的對數成線性關系第5頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月根據此性質，可對具有相同電荷，不同分子量的蛋白質進行分離。第6頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月電泳技術分類影響電泳遷移率的因素

①電場強度。電場強度是指單位長度(cm)的電位降．也稱電勢梯度。根據電場強度不同，將電泳分為常壓電泳(2-10V/cm)和高壓電泳(20-200V/cm)。電場強度高，帶電質點的遷移率加速，因此省時，但會產生大量熱量。

第7頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月②溶液的pH值。溶液的pH值決定被分離物質的解離程度和質點的帶電性質及所帶凈電荷量。對于帶有兩性基團的電解質，溶液存在一pH值，此時，溶液所帶正負電荷相等，即分子的凈電荷等于零，此時，在電場中不再移動，這一pH值稱為電解質的等電點（isoelectricpoint,PI)。若溶液pH值處于等電點酸側，即pH＜pI，則蛋白質帶正電荷，在電場中向負極移動；若溶液pH值處于等電點堿側，即pH＞pI，則蛋內質帶負電荷,向正極移動。溶液的pH值離pI越遠，質點所帶凈電荷越多，電泳遷移率越大。第8頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月③溶液的離子強度一方面，電泳液中的離子濃度增加時會引起質點遷移率的降低。帶電質點吸引相反電荷的離子聚集其周圍，形成一個與運動質點電荷相反的離子氛(ionicatmosphere),離子氛不僅降低質點的帶電量，同時增加質點前移的阻力，甚至使其不能泳動。另一方面，離子濃度過低，會降低緩沖液的總濃度及緩沖容量，不易維持溶液的pH值，影響質點的帶電量，改變泳動速度。第9頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月④電滲。在電場作用下液體對于固體支持物的相對移動稱為電滲(electro—osmosis)。由于電滲的影響，質點遷移的表觀速度不同于其固有速度。因固體支持物多孔，且?guī)в锌山怆x的化學基團，因此常吸附溶液中的正離子或負離子，使溶液相對帶負電或正電。如以濾紙作支持物時，紙上纖維素吸附OH-帶負電荷，而與紙接觸的水溶液因產生H3O+，帶正電荷移向負極，若質點原來在電場中移向負極，結果質點的表觀速度比其固有速度要快；若質點原來移向正極，表觀速度比其固有速度要慢。因此．應盡可能選擇低電滲作用的支持物以減少電滲的影響。第10頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月電泳的技術問題和對策：影響遷移速率的主要因素（1）各組分的分子凈電荷數;(2)分子量;(3)電泳系統(tǒng)介質的有效黏滯度。（1）一般控制溶液pH4.5-9.5范圍內。（2）選擇適當的緩沖系統(tǒng)。（3）表面活性劑（4）控制電泳系統(tǒng)介質的有效黏滯度第11頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月（5）電泳過程的產熱問題A、蛋白質變性;B、引起區(qū)帶擴散，降低分辨率。最常采用的辦法是將電泳產生的熱量從電泳系統(tǒng)中移出，保持電泳溫度恒定。第12頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月概述——過程特點第11章色譜分離過程色譜法指多種成分的混合物，由于在流動相和固定相中有不同的分配，在流動過程中，經多次分配后而獲得分離。同其他傳統(tǒng)分離純化方法相比，色譜分離過程具有如下特點。1、應用范圍廣2、分離效率高3、操作模式多樣4、高靈敏度在線檢測第13頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月概述——過程特點色譜分離過程的基本原理

色譜分離過程的實質是溶質在不互溶的固定相和流動相之間進行的一種連續(xù)多次的交換過程，它借各組分在兩相間的分配系數、吸附能力、親和力等差異而使不同的溶質分離。即混合物中各個組分按其在兩相間分配系數的不同先后流出色譜柱而得到分離。第14頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月第15頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月概述——過程特點固定相

色譜柱填料分為球形顆粒填料和不規(guī)則形狀顆粒填料。具有較高的機械強度，不易破碎，柱的填裝重視性好，并可增加樣品在柱中的滲透性。色譜分離過程常用柱填料有以下幾種。（1）硅膠衍生的固定相;（2）活性炭;（3）離子交換樹脂;（4）大孔吸附樹脂;（5）凝膠;（6）手性固定相.第16頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月概述——過程特點色譜柱及柱技術

色譜柱是色譜技術的核心，色譜柱的性能依賴于三個因素：色譜柱填充技術、柱設計和生產。（1）色譜柱填裝方法第17頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月概述——過程特點（2）色譜柱設計以使被分離物質以“面進樣”而不是“點進樣”的方式分布在柱頭截面上，形成平整的活塞流，減少譜帶擴張。

第18頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月概述——過程特點色譜的分類

1、按兩相狀態(tài)分類按流動相狀態(tài)分類氣相色譜（GC);液相色譜（LC);超臨界流體色譜（SFC)。按固定相狀態(tài)分類氣-固色譜（GSC);氣-液色譜（GLC)液-固色譜（LSC);液-液色譜（LLC）第19頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月概述——過程特點色譜的分類

2、按處理量分類根據分離樣品量的不同，以分離純化為目的的色譜可分為：半制備（semi-preparative，微克級至克級）、大規(guī)模（Largescale，克級至千克級）、生產型（industrialscaleorprocess，克級至千克級）幾種類型色譜。第20頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月概述——過程特點色譜的分類3、按分離機制分類①分子排阻色譜或凝膠過濾色譜（sizeexclusionchromatography，SEC或gelfiltrationchromatography，GC）。②離子交換色譜（ionexchangechromatography，IEC）。第21頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月概述——過程特點色譜的分類3、按分離機制分類③疏水作用色譜（hydrophobicinteractionchromatography，HIC）。④親和色譜（affinitychromatography，AC）。⑤正相/反相色譜（normal/reversedphasechromatography，N/RPC第22頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月概述——過程特點色譜的分類3、按使用目的分類①分析用色譜②制備用色譜③流程用色譜第23頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月概述——過程特點色譜分離過程基礎理論

保留值、分離度和柱效應（1）保留值保留值通常以保留時間及容量因子來表示。保留值是色譜過程的基本熱力學參數之一。它也是色譜定性的基本依據。從進樣開始到柱后出現樣品的濃度極大值所需的時間為保留時間，與固定相和流動相的性質、柱溫、流速、柱體積等因素有關。

第24頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月概述——過程特點色譜分離過程基礎理論容量因子指在一定溫度和壓力下，組分在固定相和流動相之間達到平衡時的質量之比。它與柱尺寸及流速無關，而與溶質在兩相間的分配性質、柱溫及固定相和流動相之體積比有關。第25頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月概述——過程特點色譜分離過程基礎理論

保留值、分離度和柱效應（1）分離度相鄰色譜峰峰頂之間的距離除以兩色譜峰的平均寬度。

當R=1時，兩色譜峰的分離程度可達94%；當R=1.5時，兩個色譜峰已完全分離。第26頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月概述——過程特點色譜分離過程基礎理論

保留值、分離度和柱效應（1）柱效應：用塔板高度和塔板數衡量色譜柱效應。

有效塔板數和有效塔板高度

第27頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月概述——過程特點色譜分離過程基礎理論

色譜理論模型（1）速度方程理論

A、B、C分別代表渦流擴散系數、分子擴散項系數和傳質阻力項系（2）平衡色譜理論假定在整個過程中，色譜柱中不存在傳質阻力，溶質在固定相和流動相中分配平衡能瞬間完成。第28頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月概述——過程特點色譜分離過程基礎理論

即在色譜柱內任何時刻和位置，溶質在固定相和流動相中的濃度均符合等溫方程由于忽略了非理想流動及各種傳質阻力的存在，這個模型是比較粗略的。

第29頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月概述——過程特點色譜分離過程基礎理論（3）塔板理論塔板理論將色譜過程比擬為蒸餾過程，不同色譜柱看成是由一系列理論塔板所組成。在一個理論板當量高度HETP的柱高內，溶質在兩相間達到一次平衡。由塔板理論可計算理論塔板數及塔板高度.但它是半經驗式理論，不能揭示色譜過程本質。第30頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月概述——過程特點色譜分離過程基礎理論（4）軸向擴散理論在色譜過程中，組分在流動相中的軸向擴散是影響色譜區(qū)域譜帶擴張的主要因素，而有限的傳質速率對區(qū)域譜帶擴張沒有影響。軸向擴散理論的基本方程為

軸向擴散理論考慮了溶質在流動相和固定相間的傳質速率及流動相的流動狀態(tài)，當傳質速率較快而軸向擴散為區(qū)域擴張的主要因素時，該理論具有較好的指導意義。第31頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月概述——過程特點氣相色譜及其應用氣相色譜儀以惰性氣體（載氣）作為流動相，以固定液或固體填充劑作為固定相的色譜設備。處理的對象是低分子量或易揮發(fā)化合物。不適宜高分子化合物及熱敏性化合物的分離和分析。第32頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月概述——過程特點氣相色譜及其應用氣相色譜儀氣路系統(tǒng)(氣源、凈化器、氣流控制裝置）;進樣系統(tǒng)(注射器、六通閥、自動進樣器）;分離系統(tǒng)(色譜柱、柱箱）;檢測系統(tǒng)和數據處理系統(tǒng)。第33頁，課件共37頁，創(chuàng)作于2023年2月概述——過程特點高效液相色譜及其應用高效液相色譜儀以液體為流動相的色譜技術，具有以下特點：高壓、高速、高效、高靈敏度且分析使用樣品量小。組成：高壓輸液系統(tǒng)、進