PCR技術(shù)(環(huán)境微生物)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

（PCR）

目前一頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點概述原理流程操作方法應(yīng)用目前二頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點一、PCR的概述：

PCR（polymerasechainreaction)：

Polymerase:DNA聚合酶

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，又稱體外DNA擴(kuò)增技術(shù)。也稱無細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)近年來發(fā)展起來的一種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)。目前三頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點DNA擴(kuò)增的傳統(tǒng)方法：一般采用分子克隆法，需將構(gòu)建的含有目的基因的載體導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，并需要用探針進(jìn)行篩選，牽扯到DNA酶切、連接、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)及探針雜交等技術(shù)，雖然技術(shù)上已無難點，但操作復(fù)雜，需數(shù)周到數(shù)月的時間，且不利于普及。目前四頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點PCR技術(shù)的發(fā)展歷史

關(guān)于PCR的文章首次由美國科學(xué)家KaryMullis等人在《Science》雜志上發(fā)表《Science》雜志報道了耐熱性DNA多聚酶Taq酶（生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內(nèi)提取到的一種耐熱的DNA聚合酶）的發(fā)現(xiàn),預(yù)示著分子時代的到來。12月《Science》雜志將PCR和它所使用的聚合酶命名為第一個“年度分子”。1993KaryMullis因PCR的發(fā)明獲得諾貝爾化學(xué)獎。目前五頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點

優(yōu)點：敏感度高、特異性強、產(chǎn)率高、重復(fù)性好以及快速簡便等，廣泛應(yīng)用于微生物學(xué)、考古學(xué)、法醫(yī)學(xué)及體育等領(lǐng)域，并已普及到許多普通實驗室，大大簡化了傳統(tǒng)的分子克隆技術(shù)，從而比較容易地對目的基因進(jìn)行分析、鑒定。

PCR能將微量的DNA大幅增加，因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進(jìn)行比對。目前六頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點PCR技術(shù)的原理遺傳物質(zhì)：細(xì)胞核染色體DNA（脫氧核糖核酸和磷酸鏈和堿基構(gòu)成)堿基（A、T、C、G）是按雙鏈螺旋排列的，堿基序列的

長度和排列的順序決定了生物的多樣性。比如人類體細(xì)胞中共有31億個堿基對，按上述的0.1%的差，人和人之間有3百萬個堿基對的差別。目前七頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點PCR的原理2：

用于擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA片段，類似于天然DNA的復(fù)制過程。以擬擴(kuò)增的DNA分子為模板，以一對分別與模板5′末端和3′末端互補的寡核苷酸片段（只有20個以下堿基的核苷酸的總稱）為引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留復(fù)制的機(jī)制沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成，重復(fù)這一過程，即可使目的DNA片段得到擴(kuò)增。目前八頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點PCR的原理3

PCR是一種體外DNA擴(kuò)增技術(shù)，是在模板DNA、引物和４種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促合反應(yīng)，將待擴(kuò)增的DNA片段與其兩側(cè)互補的寡核苷酸鏈引物經(jīng)“高溫變性——低溫退火——引物延伸”三步反應(yīng)的多次循環(huán)，使DNA片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加，從而在短時間內(nèi)獲得我們所需的大量的特定基因片段。目前九頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點擴(kuò)增的特異性取決于引物與模板DNA的特異結(jié)合，基本反應(yīng)步驟分三步：1.變性(Denaturation)：加熱使模板DNA雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈。94℃30″2.退火(復(fù)性)(Annealling):突然降溫后模板DNA與引物按堿基配對原則互補結(jié)合，也存在兩條模板鏈之間的結(jié)合，但由于引物的高濃度，結(jié)構(gòu)簡單的特點，主要的結(jié)合發(fā)生在模板與引物之間。55℃30″目前十頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點3.延伸(Extension):將反應(yīng)溫度調(diào)節(jié)到酶的最適溫度，在DNA聚合酶、4種dNTPs及鎂離子等存在的條件下，以引物的3′端開始，結(jié)合單核苷酸，形成與模板鏈互補的新DNA鏈。72℃上述3步為一個循環(huán)，每經(jīng)過一個循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過25～40個循環(huán)后DNA可擴(kuò)增106～109倍。目前十一頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點

PCR的三個反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA擴(kuò)增量可用Y＝(1＋X)n計算。Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為100%，但在實際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。

反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱平臺期數(shù)、PCR擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的竟?fàn)幍纫蛩?。大多?shù)情況下，平臺期的到來是不可避免的。目前十二頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點雙鏈DNA分子目前十三頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點雙鏈斷開

循環(huán)1目前十四頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點模板與引物結(jié)合循環(huán)1TaqTaq目前十五頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點循環(huán)1TaqTaq目前十六頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點循環(huán)1目前十七頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點循環(huán)1目前十八頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點雙鏈斷開循環(huán)2目前十九頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點模板與引物結(jié)合循環(huán)2TaqTaqTaqTaq目前二十頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點循環(huán)2目前二十一頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點94℃變性雙鏈斷開循環(huán)3目前二十二頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點循環(huán)3TaqTaqTaqTaqTaqTaqTaqTaq目前二十三頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點循環(huán)3目前二十四頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點循環(huán)n目前二十五頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點

PCR擴(kuò)增的特異性是由一對寡核苷酸引物所決定的。反應(yīng)初期，原來的DNA擔(dān)負(fù)起使模板的作用，隨著循環(huán)次數(shù)的遞增，由引物介導(dǎo)延伸的片段急劇增多而成為主要模板，最終的擴(kuò)增產(chǎn)物是介于兩種引物5’端之間的DNA片段。目前二十六頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系：

10×擴(kuò)增緩沖液10ul

4種dNTP混合物各200umol/L

引物各10～100pmol

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100ul

目前二十七頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點三、PCR的成分和作用：1.緩沖液：10～50mMTris-Cl（三氨基甲烷）(pH8.4)維持Taq酶作用環(huán)境的偏堿性25～50mMKCl

促進(jìn)引物退火，>50mM會抑制Taq酶的活性。100μg/ml牛血清白蛋白(BSA)對酶有一定的保護(hù)性，如質(zhì)量不好將起相反的作用，建議使用乙酰化的BSA。明膠、Tween-20、二硫蘇糖醇(DTT)也有類似作用。目前二十八頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點2.MgCl2:1.5～2.0mMTaq酶具有Mg2+依賴性，顯著影響反應(yīng)的特異性和擴(kuò)增片段的產(chǎn)量，過量能增加非特異擴(kuò)增并影響產(chǎn)率，過低則酶活性顯著下降。目前二十九頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點3.dNTPs:dATP、dGTP、dCTP、dTTP——底物0.02～0.2mMdNTPs可與Mg2+結(jié)合，應(yīng)注意Mg2+濃度與dNTPs

濃度之間的關(guān)系，Mg2+濃度比dNTPs濃度高0.2～2.5mM。過高：加快反應(yīng)速度，還可增加堿基的錯誤摻入率和室驗成本。過低：反應(yīng)速度下降，可提高實驗的精確性。目前三十頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點4.引物(Primer-P)：預(yù)擴(kuò)增核酸片段兩端的已知序列，決定特異性。0.2～1μM偏高：非特異產(chǎn)物擴(kuò)增及錯配，增加引物之間形成引物二聚體，產(chǎn)量降低。偏低：產(chǎn)量降低。目前三十一頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點5.TaqDNA聚合酶：耐高熱0.5～5U/100μl1U/25～50μl偏高：引物非特異產(chǎn)物的擴(kuò)增偏低：產(chǎn)物量降低目前三十二頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點6.模板DNA(Template):最低102～105bpDNA片段，實際用量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過此量，用量需在實驗中摸索。1～5μl過高：非特異產(chǎn)物增加過低：產(chǎn)量降低7.水：去離子水，補足整個反應(yīng)體積。目前三十三頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點PCR實驗實驗材料1·模板：細(xì)菌DNA2·TagDNA聚合酶

3·dNTP混合液

4·10倍濃度PCR緩沖液

5·2.5mmol/LMgCl26·RAPD引物：S14S15S18S66S74S88S97S103S110S1157·提取細(xì)菌DNA的相關(guān)試劑目前三十四頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點操作步驟1．細(xì)菌染色體DNA的提取2．RAPD反應(yīng)體系的配置目前三十五頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點3·反應(yīng)程序：

將RAPD反應(yīng)試劑加入EP管中輕混后用100ul石蠟油覆蓋于反應(yīng)混合液之上，防止樣品在反復(fù)加熱-冷卻的過程中蒸發(fā)，蓋好蓋子目前三十六頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點打開PCR反應(yīng)儀輸入以下反應(yīng)數(shù)據(jù)94攝氏度預(yù)變性5min94攝氏度變性40s40攝氏度退火40s72攝氏度延伸1min將EP管放入儀器開始擴(kuò)增，循環(huán)35次；72攝氏度延伸10min儀器為ModelMyGene25Plus目前三十七頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析1、凝膠電泳分析法：聚丙烯酰胺凝膠電泳靈敏度遠(yuǎn)高于瓊脂糖電泳，用于探討PCR擴(kuò)增的靈敏度效果好，但配制復(fù)雜，常用瓊脂糖凝膠電泳。2、點雜交3、微孔板雜交法目前三十八頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點PCR技術(shù)的局限性為了構(gòu)建特定引物，使特定DNA序列的選擇性擴(kuò)增，必須有一個龐大的已知序列的數(shù)據(jù)庫。聚合酶鏈反應(yīng)效率差異很大，根據(jù)不同的因素需要優(yōu)化反應(yīng)條件。PCR技術(shù)擴(kuò)增產(chǎn)物的長度有限。目前三十九頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點PCR技術(shù)的主要用途1、目的基因的克隆：PCR技術(shù)為在重組DNA過程中獲得目的基因片段提供了簡便快速的方法。2、基因的體外突變：可以隨意設(shè)計引物在體外對目的基因片段進(jìn)行嵌和、缺失、點突變等改造。

目前四十頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點3、DNA和RNA的微量分析：PCR技術(shù)高度敏感，對模板ＤＮＡ的含量要求很低，是DNA和ＲNA微量分析的最好方法。實際工作中，一滴血液、一根毛發(fā)或一個細(xì)胞已足以滿足PCR的檢測需要，因此在基因診斷方面具有極廣闊的應(yīng)用前景。4、DNA序列測定：PCR技術(shù)的引入使DNA測序工作大大簡化，也提高了測序的速度。5、基因突變分析：

利用PCR與一些技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測的敏感性。目前四十一頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點DNA指紋技術(shù)11984年英國的遺傳學(xué)家AlecJeffreys在進(jìn)行肌紅蛋白的DNA序列研究時，意外發(fā)現(xiàn)非功能DNA（不產(chǎn)生蛋白的DNA）上重復(fù)著一種小片段DNA，這一含15個左右堿基的DNA片段，在不同個體間重復(fù)的頻率及位置有明顯的不同，Jeffreys首先在自己的DNA上進(jìn)行研究，驗證了這一技術(shù)，如果我們有血緣關(guān)系，這些不同會大大縮小。目前四十二頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點DNA指紋技術(shù)2采集血樣（毛發(fā)、精液、口腔粘膜細(xì)胞），分離DNA，用PCR將選定的DNA片段放大，并進(jìn)行對比，統(tǒng)計分析，便可得出是否為作案兇手或是否有血緣關(guān)系。目前四十三頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點PCR在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用不同的微生物病原體具有不同的致病劑量，因此確定水樣中病原體的數(shù)量和種類提高檢測的準(zhǔn)確度顯得異常重要水體污染問題已引起了人們的極大關(guān)注,確定自然水體或污水水樣中受病原體或化學(xué)類污染物污染的程度和快速確定污染源是一個難點問題。飲用水樣品中只有不到1%的微生物可經(jīng)實驗室培養(yǎng)。因此,用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法研究微生物群落,不能反映環(huán)境的真實情況。而PCR技術(shù)靈敏,便捷又具有特異性,可以針對某種或某幾種致病微生物作出檢測判斷,因此在水環(huán)境微生物檢測中應(yīng)用越來越廣泛,表現(xiàn)目前四十四頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點PCR技術(shù)在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用

DNA損傷評價污染物遺傳毒性的一個很有價值的生物指標(biāo),PCR技術(shù)的應(yīng)用使得在分子水平分析DNA損傷之一DNA突變有了很大的進(jìn)展,提供了一種在分子水平上分析環(huán)境生物DNA損傷和檢測病原體的簡便方法,該方法克服了傳統(tǒng)方法的缺陷,更利于提高環(huán)境檢測的效率和準(zhǔn)確性。目前四十五頁\總數(shù)四十九頁\編于十五點PCR技術(shù)在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用PCR有許多不同種類，如實時定量PCR，多重PCR等，用PCR得到的母的片段可用于微生物檢測。目前已有將PCR技術(shù)用于飲用水中大腸桿菌的檢測；