基礎(chǔ)生物學實驗(三)基礎(chǔ)生物學實驗(安徽大學生物研究生復試,生命科學學院)

基礎(chǔ)生物學實驗(三)

生物化學

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2005）孔小衛(wèi)黃訓端安徽大學基礎(chǔ)生物實驗教學中心二零零五年六月目前一頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點目錄實驗一糖類的定量測定實驗二紙層析法分析氨基酸實驗三血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳實驗四酵母RNA的提取及含量測定實驗五外界因素對酶活性的影響實驗六碘滴定法測定抗壞血酸目前二頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點實驗一糖類的定量測定—3，5-二硝基水楊酸比色定糖法一、實驗目的1．掌握3，5一二硝基水楊酸法定糖的原理及方法。2．用3，5一二硝基水楊酸比色法測定山芋粉中總糖。3．熟悉分光光度計的原理及使用方法。二、實驗原理

糖類的測定方法有物理方法和化學方法兩類。由于化學方法比較準確，常常使用之。還原糖的測定是糖定量測定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基和酮基的糖類。目前三頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點3，5一二硝基水楊酸與還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)，棕紅色物質(zhì)顏色的深淺程度與還原糖的量成正比。因此，我們可以利用比色法測定樣品中還原糖以及總糖的含量。該法是半微量定糖法，操作簡便、快速，雜質(zhì)干擾較少。三、實驗操作（一）樣品中總糖的水解及提取準確稱取山芋粉1g，放入小三角燒瓶中，加入10ml6NHCL和15ml蒸餾水，混勻。在沸水浴加熱30min后，用KI-I2溶液檢查水解程度。若已水解完全，則不呈現(xiàn)藍色。冷卻后加入酚酞試劑一滴，以10%NaOH中和至溶液呈微紅色。過濾并定容至100ml。再精確吸取上述溶液10ml，放入100ml容量瓶，稀釋到刻度，備用。（二）葡萄糖標準曲線的制作取7支大試管分別按表1-1順序加入各種試劑。目前四頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點表1-1制作葡萄糖標準曲線時各試劑用量項目空白123456含糖總量（mg）00.40.60.81.01.21.4葡萄糖液（ml）00.40.60.81.01.21.4蒸餾水（ml）2.01.61.41.21.00.80.6DNS試劑(m1)1.51.51.51.51.51.51.5加熱均在沸水浴中加熱5min冷卻立即用流動冷水冷卻蒸餾水(ml)21.5

21.521.521.521.521.521.5光密度(O.D．520)

目前五頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點將以上各管溶液混勻后，用分光光度計(520nm)進行比色測定，用空白管溶液調(diào)零點，記錄光密度值，以葡萄糖濃度為橫坐標，光密度為縱坐標，繪制出標準曲線。一大組同學做一個標準曲線（三）樣品中含糖量的測定取4支大試管，分別按表1—2加入各種試劑。目前六頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點表1—2測定樣品中含糖量時各試劑的用量項目空白123樣品量（ml）01.01.01.0蒸餾水（ml）2.01.01.01.0DNS試劑(m1)1.51.51.51.5加熱均在沸水浴中加熱5min冷卻立即用流動冷水冷卻蒸餾水(ml)21.5

21.521.521.5光密度(O.D．520)目前七頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點將各管混勻后，按制作標準曲線時同樣的操作測定各管的光密度，在標準曲線上查出相應的總糖含量，按下述公式計算出山芋粉總糖百分含量?？偺?（水解后還原mg數(shù)×樣品稀釋倍數(shù)×100％）/樣品重量目前八頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點四、實驗要求1.實驗過程中所有的試管要干凈，加入各種試劑量要準確。2.試劑不可倒出試劑瓶，用干凈的移液管吸取，用后蓋好瓶塞，防回原處。3.分光光度計使用：溶液不要倒太多；毛邊不要對著透光處；用后用自來水沖洗干凈，防回原處。4.移液管使用：有色看外邊緣，無色看中間凹處。5.實驗室中所有的儀器上面不能放置燒杯、試管、試劑瓶等，以防試劑污染儀器。6.每組同學離開實驗室時，須經(jīng)實驗老師檢查并同意后，方可離開。7.值日生打掃干凈實驗室后，方可離開。目前九頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點

實驗二紙層析法分析氨基酸一、實驗目的1.掌握紙上層析的一般原理和操作方法。2.了解氨基酸的特征性顏色反應。3.學會分析未知樣品的氨基酸成分。二、實驗原理

紙上層析法是分配層析法中的一種，常以濾紙為惰性支持物。紙上層析法是分離、鑒定和定量測定氨基酸、糖類、抗生素等有機物質(zhì)的一項重要而簡便的分析方法。所用設備簡單、操作方便，使用樣品少，分離效果好，為近代生物化學分析中重要技術(shù)之一。此法廣泛地應用于科研和生產(chǎn)分析工作中。目前十頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點

紙上層析的原理：常以水和有機溶劑作為展層劑；水和有機溶劑互溶后形成兩個相：一個是飽和了有機溶劑后的水相，一個是飽和了水后的有機溶劑相。由于濾紙纖維素上的羥基和水分子有較大的親和力，而與有機溶劑的親和力相對較弱，因此我們認為水相為固定相，有機溶劑相為移動相。由于物質(zhì)的極性大小不同，在兩相中分配比例有所差異。極性小的物質(zhì)在有機相中分配較多，隨有機相移動較快；而極性大的物質(zhì)在水相中分配較多，移動相對較慢，從而將極性不同的物質(zhì)分開。一般來說，在相同的條件下，每種物質(zhì)都有其固定的Rf值。Rf值的定義為：Rf=(原點到層析斑點中心的距離)/（原點到溶劑前沿的距離）目前十一頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點影響Rf值的因素有：①物質(zhì)本身的化學結(jié)構(gòu)；②展層所用溶劑系統(tǒng)；③展層劑pH值；④展層時的溫度；⑤展層所用濾紙；⑥展層的方向(橫向，上行或下行)。用紙層析鑒定樣品時，一般都與標準品相比較。若沒有標準品，可選擇文獻記載的該物質(zhì)層析條件，根據(jù)文獻Rf值進行鑒定。目前十二頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點

三、實驗操作

1．紙的處理取18cm長、18cm寬的濾紙一張，離底邊2cm處用鉛筆輕輕劃一條與底邊平行的線，并等距離的在線上定點樣點(原點)劃圈，使圈的直徑小于0.5cm。2．點樣在每個圈下用鉛筆記上每種氨基酸的代號（混合樣可寫M），然后用毛細管吸取樣品，輕輕地點到相應的氨基酸圈內(nèi)，待晾干或用冷風吹干后再點1次。每個樣品共點2次。3．層析將點好樣的濾紙縱向卷起來，點樣面向里，點樣點位于一端，用針線縫成筒狀，不要使濾紙兩邊接觸(見圖1)。將培養(yǎng)皿中放入2／3量的展層劑，放入層析缸中，然后將濾紙直立于層析缸的培養(yǎng)皿中，樣品端向下垂直放置，切勿使展層劑浸到樣品點，開始層析。當溶劑前沿到達離上端2cm處，取出濾紙，用鉛筆描出溶劑前沿，晾干。目前十三頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點圖1.濾紙的縫合目前十四頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點4．顯色用噴霧器向濾紙上均勻噴灑0.1%茚三酮，晾干后，將濾紙放入烘箱中(80-100℃)，烘烤5分鐘后，濾紙上即顯出紫紅色的氨基酸斑點。用鉛筆描出斑點輪廓(見圖2)

四.結(jié)果處理

用尺量出原點到斑點中心距離以及原點到溶劑前沿距離，計算各標準氨基酸和混合氨基酸的Rf值。目前十五頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點圖2.層析譜

1．原點；2．層析點；3．溶劑前沿目前十六頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點五、實驗建議(1)在整個操作過程中，手只能接觸濾紙邊緣，否則手指上的氨基酸會造成濾紙上眾多斑點。(2)在點樣時，不要將毛細管插錯了試劑瓶。(3)展層結(jié)束后，切勿忘記用鉛筆描出溶劑前沿。(4)點樣斑點不能太大（其直徑應小于0.5cm），防止氨基酸斑點重復；吹風溫度不宜過高，否則斑點變黃。(5)根據(jù)目的、要求，選擇合適溶劑系統(tǒng)。目前十七頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點實驗三血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳一、實驗目的1.學習醋酸纖維素薄膜電泳的基本原理。2.了解醋酸纖維素薄膜電泳的操作技術(shù)。3.掌握電泳分離血清蛋白質(zhì)及其定性定量的方法。

二、實驗原理醋酸纖維素薄膜電泳是以醋酸纖維素薄膜為支持物的電泳方法。醋酸纖維素是纖維素的羥基乙酰化形成的纖維素醋酸酯。將它溶于有機溶劑(如丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等)后，涂抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀結(jié)構(gòu)，有強滲透性，對分子移動無阻力，厚度為120um。目前十八頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點二、實驗原理本實驗以醋酸纖維素為電泳支持物，分離各種血清蛋白。血清中含有清蛋白、a一球蛋白、β一球蛋白、γ一球蛋白和各種脂蛋白等。各種蛋白質(zhì)由于氨基酸組分、立體構(gòu)象、分子量、等電點及形狀不同，在電場中遷移速度不同。分子量小、等電點低，在相同堿性pH緩沖體系中，帶負電荷多的蛋白質(zhì)顆粒在電場中遷移速度快。例如，以醋酸纖維薄膜為支持物，正常人血清在pH8．6的緩沖體系中電泳1h左右，染色后可顯示5條區(qū)帶。清蛋白泳動最快，其余依次為α1-、α2-、β-、γ-球蛋白。這些區(qū)帶經(jīng)洗脫后可用分光光度法定量，也可直接進行光吸收掃描，自動繪出區(qū)帶吸收峰及相對百分比，臨床醫(yī)學常用它們間相對百分比的改變或異常區(qū)帶的出現(xiàn)作為臨床鑒別診斷的依據(jù)。

目前十九頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點三、實驗操作（一）儀器與薄膜的準備1.醋酸纖維素薄膜的潤濕與選擇2.電泳槽的準備在兩個電極槽中，各倒人等體積的電極緩沖液，在電泳槽的兩個膜支架上各放兩層濾紙條，使濾紙一端的長邊與支架前沿對齊，另一端浸入電極緩沖液內(nèi)。當濾紙條全部潤濕后，用玻璃棒輕輕擠壓在膜支架上的濾紙以驅(qū)逐氣泡，使濾紙的一端能緊貼在膜支架上。濾紙條是兩個電極槽聯(lián)系醋酸纖維素薄膜的橋梁，故稱為濾紙橋。3.電極槽的平衡目前二十頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點（二）點樣用竹夾子取出薄膜，將無光澤面向上平放在濾紙上。點樣區(qū)距陰極端1.5cm處，點樣時，先用玻璃棒取血清，均勻涂在點樣器表面(該點樣器是由載玻片一端磨成具有斜面而成}，再將點樣器輕輕印在點樣區(qū)內(nèi)，如圖所示，使血清完全滲透至薄膜內(nèi)，形成一定寬度、粗細均勻的直線。此步是實驗的關(guān)鍵，是獲得具有清晰區(qū)帶的電泳圖譜的重要環(huán)節(jié)。

目前二十一頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點圖11—2

醋酸纖維素薄膜規(guī)格及點樣位置示意圖虛線處為點樣位置目前二十二頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點（三）電泳先恒流，后恒壓用竹夾子將點樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上(點樣面朝下)、另一端平貼在陽極端支架上(如圖所示)。要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂。如一電泳槽中同時安放幾張薄膜，則薄膜之間應相隔幾毫米。蓋上電泳槽蓋，使薄膜平衡10min。用導線將電泳槽的正、負極與電泳儀的正、負極分別連接，注意不要接錯，在室溫下電泳，打開電源開關(guān)，用電泳儀上細調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)到每厘米膜寬電流強度為0.3mA（8片薄膜則為4.8mA）通電10～15min，將電壓調(diào)節(jié)到90～110V，電泳時間50～60min。電泳后調(diào)節(jié)旋鈕電流為O，關(guān)閉電泳儀切斷電源。目前二十三頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳一、實驗目的1.學習醋酸纖維素薄膜電泳的基本原理。2.了解醋酸纖維素薄膜電泳的操作技術(shù)。3.掌握電泳分離血清蛋白質(zhì)及其定性定量的方法。

二、實驗原理

醋酸纖維素薄膜電泳是以醋酸纖維素薄膜為支持物的電泳方法。醋酸纖維素是纖維素的羥基乙?；纬傻睦w維素醋酸酯。將它溶于有機溶劑(如丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等)后，涂抹成均勻的薄膜則成為醋酸纖維素薄膜。該膜具有均一的泡沫狀結(jié)構(gòu)，有強滲透性，對分子移動無阻力，厚度為120um。

目前二十四頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點作為區(qū)帶電泳的支持物進行蛋白電泳，它具有微量、快速、簡便、分辨力高、對樣品無拖尾和吸附現(xiàn)象等優(yōu)點，該技術(shù)已廣泛應用于血清蛋白、血紅蛋白、糖蛋白、脂蛋白、結(jié)合球蛋白、同功酶的分離和測定等方面。本實驗以醋酸纖維素為電泳支持物，分離各種血清蛋白。血清中含有清蛋白、a一球蛋白、β一球蛋白、γ一球蛋白和各種脂蛋白等。各種蛋白質(zhì)由于氨基酸組分、立體構(gòu)象、分子量、等電點及形狀不同(見表1)，在電場中遷移速度不同。分子量小、等電點低，在相同堿性pH緩沖體系中，帶負電荷多的蛋白質(zhì)顆粒在電場中遷移速度快。

目前二十五頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點圖ll一1正常人血清醋酸纖維素薄膜電泳示意圖1為清蛋白；2，3，4，5分別為α1-，α2-，β-及γ-球蛋白；6為點樣原點

此法由于操作簡單快速、分辨率高及重復性好等優(yōu)點，目前已成為臨床生化檢驗的常規(guī)操作之一。它不僅可用于分離血清蛋白，還可用于分離脂蛋白、血紅蛋白及同工酶的分離測定。目前二十六頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點三、實驗操作

（一）儀器與薄膜的準備1.醋酸纖維素薄膜的潤濕與選擇用竹夾子取一片薄膜，小心平放在盛有緩沖液的平皿中。若漂浮于液面的薄膜在15～30s內(nèi)迅速潤濕，整條薄膜色澤深淺一致，則此膜均勻可用于電泳；若薄膜潤濕緩慢，色澤深淺不一或有條紋及斑點，則表示薄膜厚薄不均勻應棄去，以免影響電泳結(jié)果。浸泡于緩沖液中約30min，當完全浸透后，用鑷子輕輕取出，夾在兩層濾紙內(nèi)吸去多余液體，用于電泳。

目前二十七頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點

2.電泳槽的準備根據(jù)電泳槽膜支架的寬度，剪裁尺寸合適的濾紙條。在兩個電極槽中，各倒人等體積的電極緩沖液，在電泳槽的兩個膜支架上各放兩層濾紙條，使濾紙一端的長邊與支架前沿對齊，另一端浸入電極緩沖液內(nèi)。當濾紙條全部潤濕后，用玻璃棒輕輕擠壓在膜支架上的濾紙以驅(qū)逐氣泡，使濾紙的一端能緊貼在膜支架上。濾紙條是兩個電極槽聯(lián)系醋酸纖維素薄膜的橋梁，故稱為濾紙橋。

3.電極槽的平衡用平衡裝置(或自制平衡管)連接兩個電極槽，使兩個電極槽內(nèi)的緩沖液彼此處于同一水平狀態(tài)，一般需平衡15～20min。注意，取出平衡裝置時應將活塞關(guān)緊。

目前二十八頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點（二）點樣1.制備點樣模板取一張干凈濾紙(10cm×10cm)，在距紙邊1.5cm處用鉛筆劃一平行線，此線為點樣標志區(qū)。2.點樣用竹夾子取出薄膜，將無光澤面向上平放在濾紙上。點樣區(qū)距陰極端1.5cm處，點樣時，先用玻璃棒或血色素吸管取2～3ml血清，均勻涂在點樣器表面(該點樣器是由載玻片一端磨成具有斜面而成}，再將點樣器輕輕印在點樣區(qū)內(nèi)，如圖2所示，使血清完全滲透至薄膜內(nèi)，形成一定寬度、粗細均勻的直線。此步是實驗的關(guān)鍵，點樣前應在濾紙上反復練習，掌握點樣技術(shù)后再正式點樣是獲得具有清晰區(qū)帶的電泳圖譜的重要環(huán)節(jié)。

目前二十九頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點（三）電泳用竹夾子將點樣端的薄膜平貼在陰極電泳槽支架的濾紙橋上(點樣面朝下)、另一端平貼在陽極端支架上(如圖3所示)。要求薄膜緊貼濾紙橋并繃直，中間不能下垂。如一電泳槽中同時安放幾張薄膜，則薄膜之間應相隔幾毫米。蓋上電泳槽蓋，使薄膜平衡10min。用導線將電泳槽的正、負極與電泳儀的正、負極分別連接，注意不要接錯，在室溫下電泳，打開電源開關(guān)，用電泳儀上細調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)到每厘米膜寬電流強度為0.3mA（8片薄膜則為4.8mA）通電10～15min，將電壓調(diào)節(jié)到90～110V，電泳時間50～60min。電泳后調(diào)節(jié)旋鈕電流為O，關(guān)閉電泳儀切斷電源。目前三十頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點

（四）染色和漂洗電泳完畢立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min，然后取出，先用自來水沖洗，再用漂洗液漂洗，連續(xù)更換3次漂洗液，可使顏色脫去，得到色帶清晰的電泳圖譜。

（五）透明將脫色吹干后的薄膜浸入透明甲液中2min，取出立即放入透明乙液中浸泡1min，取出后立即緊貼于干凈玻璃板上，兩者間不能有氣泡。5～10min薄膜完全透明。若透明太慢可用透明乙液少許在薄膜表面淋洗一次，垂直放置，待其自然干燥或用吹風機冷風吹干且無酸味，再將玻璃板放在流動的自來水下沖洗，當薄膜完全潤濕后用單面刀片撬開薄膜的一角，用手輕輕將透明的薄膜取下，用濾紙吸干所有的水分，最后將薄膜置液體石蠟中浸泡3min，再用濾紙吸干液體石蠟，壓干。此薄膜透明，區(qū)帶著色清晰，可用于光吸收計掃描。長期保存不褪色。目前三十一頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點（五）透明將脫色吹干后的薄膜浸入透明甲液中2min，取出立即放入透明乙液中浸泡1min，取出后立即緊貼于干凈玻璃板上，兩者間不能有氣泡。5～10min薄膜完全透明。若透明太慢可用透明乙液少許在薄膜表面淋洗一次，垂直放置，待其自然干燥或用吹風機冷風吹干且無酸味，再將玻璃板放在流動的自來水下沖洗，當薄膜完全潤濕后用單面刀片撬開薄膜的一角，用手輕輕將透明的薄膜取下，用濾紙吸干所有的水分，壓干。此薄膜透明，區(qū)帶著色清晰，可用于光吸收計掃描。長期保存不褪色。目前三十二頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點五、實驗建議(1)醋酸纖維素薄膜的預處理市售醋酸纖維素薄膜均為干膜片，薄膜的浸潤與選膜是電泳成敗的關(guān)鍵之一。為防止指紋污染，取膜時應戴指套或用夾子。所選薄膜應厚薄均勻，否則應棄去不用，以免造成電泳區(qū)帶扭曲，界線不清，背景脫色困難，結(jié)果難以重復。由于薄膜吸水性比紙小，浸泡30min以上是保證膜片上有一定量緩沖液，并使其恢復到原來多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，最好讓薄膜吸滿緩沖液后自然下沉，這樣可將膜片上聚集的小泡趕走。點樣時薄膜上的緩沖液不宜太多，但也不能太干。(2)緩沖液的選擇本實驗常用的pH8．6巴比妥緩沖液，其濃度為0．05～O．09mol／L。選用何種濃度與樣品及薄膜的厚薄有關(guān)。緩沖液濃度過低，則區(qū)帶泳動速度快，并由于擴散變寬；緩沖液濃度過高，則區(qū)帶泳動速度慢，區(qū)帶分布過于集中，不易分辨。目前三十三頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點(3)加樣量加樣品量的多少與電泳條件、樣品性質(zhì)、染色方法與檢測手段靈敏度密切相關(guān)。作為一般原則，檢測方法越靈敏，加樣量越少，對分離更有利。如加樣量過大，則電泳后區(qū)帶分離不清楚，甚至相互干擾，染色也較費時。點樣好壞是獲得理想圖譜的重要環(huán)節(jié)之一，以印章法加樣時，動作應輕、穩(wěn)，用力不能太重，以免將薄膜弄破或印出凹陷而影響電泳區(qū)帶分離效果。(4)電量選擇電泳過程應選用合適的電流強度，一般為0.3～0．5mA／cm寬膜。電流強度高，則熱效應高，可能引起蛋白質(zhì)變性或由于緩沖液蒸發(fā)造成膜片干涸。電流過低，則樣品泳動速度慢且易擴散。(5)染色液的選擇染色液應根據(jù)樣品的特點加以選擇。其原則是染料對被分離樣品有強的著色力，背景易脫色，應盡量采用水溶性染料，不宜選擇醇溶性染料，以免使薄膜溶解。

目前三十四頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點應控制染色時間。時間太長，薄膜底色深不易脫去；時間太短，著色淺不易區(qū)分，或造成染色不均勻，必要時可進行復染。(6)透明及保存透明液應臨用前配制，以免冰乙酸和乙醇揮發(fā)而影響透明效果。這些試劑最好選用分析純。透明前薄膜應完全干燥。透明時間應掌握好。如在透明乙液中浸泡時間太長則薄膜溶解，太短則透明度不佳。透明后的薄膜完全干燥后才能浸入液體石蠟中，使薄膜軟化。如有水，則液體石蠟不易浸入，薄膜不易展平。目前三十五頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點六、實驗報告及作業(yè)1．根據(jù)人血清中血清蛋白各組分等電點，如何估計它們在pH8．6的巴比妥一巴比妥鈉電極緩沖液中移動的相對位置?2.簡述醋酸纖維素薄膜電泳原理及優(yōu)點。3.繪出酸纖維素薄膜電泳結(jié)果。4.造成電泳圖譜不整齊的原因有哪些？目前三十六頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點實驗四酵母RNA的提取及含量測定

一、實驗目的1.掌握RNA提取的原理及方法。2.學會使用地衣酚法測定RNA的含量。二、實驗原理

一般的生物細胞中同時含有DNA和RNA，在酵母中RNA比DNA的含量高得多，DNA則少于2％(O．03％～O．516％)，故在實驗室常用酵母作為RNA提取的材料。若要制備具有生物活性的RNA，常用苯酚法；若對生物活性沒有要求，則可使用濃鹽法，稀堿法等。目前三十七頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點

從化學組成來說，RNA由堿基、磷酸和戊糖組成。在酸性條件下，戊糖轉(zhuǎn)化成糠醛，其可與地衣酚生成綠色復合物，反應如下：

這種復合物在670nm波長處有最大光吸收。當RNA的濃度于10～100ug／ml范圍內(nèi)，其濃度與光密度值成線性關(guān)系。樣品中少量脫氧核糖核酸(DNA)存在對測定無干擾，蛋白質(zhì)、粘多糖也干擾測定。

目前三十八頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點本實驗采用的稀堿，既可加速細胞的破裂，又可增大RNA的溶解度。當堿被中和后，可用乙醇將RNA沉淀，此為RNA的粗品。目前三十九頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點三、實驗操作(一)RNA的提取稱5g干酵母粉于150ml三角燒瓶中，加30mlO.2％的NaOH，沸水浴中攪拌提取30min。冷卻后滴加乙酸使其略偏酸性。離心(4000r／min，15min)，去除沉淀。向上清液中加入30ml95％乙醇，稍攪拌后靜置。待完全沉淀后離心(4000r／min，15min)，去上清液。沉淀加10ml95％乙醇，攪拌后再次離心。沉淀再依次用10ml的無水乙醇、乙醚(×2)洗滌。稱重，計算RNA的初步得率（a)。(二)RNA的鑒定取沉淀約O.2g，加2ml10％H2SO4→沸水浴中加熱2min→加1.5ml地衣酚試劑→沸水浴中加熱→觀察顏色變化。目前四十頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點(三)地衣酚法測定RNA含量1．標準曲線的制作取6支試管，按下表1編號及加入試劑。表l.制作RNA標準曲線時各試劑用量試劑(m1)

012345RNA標準液

00.40.81.21.62.0蒸餾水

2.01.61.20.80.40地衣酚試劑

2.02.02.02.02.02.0目前四十一頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點試劑加完后，搖勻，置沸水浴中煮45min。冷卻后，在670nm波長處測各管光密度值。以光密度為縱坐標，每管標準液ml數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線。

2．樣品中RNA的測定將(一)中制備的RNA粗品，按標準RNA液的溶解方法溶解，并配成200ug／ml的樣品液。取2支試管，分別加入1．Oml和2．Oml樣品液，用水補足至2.0ml后，各加2.0ml地衣酚試劑。余步按標準曲線制作方法。測得光密度值后，折算成1.Oml樣品液光密度值，并計算其平均值。目前四十二頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點四、計算根據(jù)所測得平均光密度值，在標準曲線上找出相應的標準RNA溶液ml數(shù)(b)，可通過下式計算酵母中RNA的含量。酵母中RNA含量=b×100×a×100％/200五、實驗建議(1)戊糖或含戊糖的物質(zhì)對本法有干擾。(2)因不同時期酵母RNA含量有所變化，若樣品光密度值均不在標準曲線范圍，可減少加樣品液量或增加RNA粗品溶液的濃度。目前四十三頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點實驗五外界因素對酶活性的影響

一、實驗目的1.了解外界因素對酶活性及酶促反應速度的影響。2.加深對酶特性的認識。

二、實驗原理酶的化學本質(zhì)是蛋白質(zhì)，它極易受外界條件的影響而改變它的構(gòu)象及性質(zhì)，因而也必然會影響到它的催化活性。酶對溫度、pH、酶濃度及某些離子濃度等變化很敏感。目前四十四頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點(一)pH值對酶活性的影響酶的活性受環(huán)境pH的影響極為顯著，通常各種酶只有在一定的pH范圍內(nèi)才能表現(xiàn)出它的活性。一種酶表現(xiàn)其最高活性時的pH值稱為該酶的最適pH。高于或低于最適pH值時，酶的活性降低。酶的最適pH值受酶的純度、底物的種類和濃度、緩沖液的種類和濃度以及環(huán)境溫度等條件影響。(二)溫度對酶活性的影響每種酶都有其最適溫度，高于或低于此溫度酶的活性都降低。一般而言，若酶處于過高的溫度環(huán)境中，會使酶活性永久地喪失；而若處于極低溫度的環(huán)境中只會使酶活性受到抑制，一旦溫度適宜，酶又會全部或部分地恢復其活性。目前四十五頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點(三)酶濃度對酶促反應速度的影響在其它條件不變的情況下，若反應物濃度大大高于酶濃度時，則反應速度隨酶濃度增加而增加，兩者間成正比關(guān)系，即：V=k[E]但若反應底物濃度較低，而且酶的濃度足夠高時，增加酶濃度，反應速度基本不變。(四)離子對酶活性的影響就唾液淀粉酶而言，低濃度Cl一可以增加酶活性，高濃度的Cl一或者低濃度的Cu2+則會抑制酶的活性，而低濃度的Na+、SO42-等對酶活性沒有影響。不同的酶對不同的離子具有不同的效應。目前四十六頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點

四、實驗操作(一)pH對酶活性的影響1．緩沖溶液的配制取6只潔凈的三角燒瓶，按表1編號和加試劑：

表1.磷酸氫二鈉一檸檬酸緩沖溶液的配制三角燒瓶號123456pH值5.46.26.87.07.48.00.2mol／L磷酸氫二鈉(m1)11.15

0.1mol／L檸檬酸(m1)8.85

目前四十七頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點2.取6支潔凈試管，分別編號后，按表2操作：表2pH對酶活性的影響管號

123456pH值

5.46.26.87.07.48.0緩沖液量(m1)

333333含NaCl的0.5％淀粉(m1)

222222稀釋100倍唾液(m1)

222222充分搖勻

37℃保溫，lmin后，用滴管從3#管中吸l滴反應液，放白瓷板用碘液檢驗(1滴)。以后每隔1min檢驗一次。當3#管反應液遇碘液呈淡黃色時，立即向6支管中加碘液

碘液(滴)

222221充分搖勻?qū)嶒灲Y(jié)果

目前四十八頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點(二)溫度對酶活性的影響取3支潔凈試管，按表3操作：

表3溫度對酶活性的影響管號

123pH6.8磷酸緩沖液(m1)

222含NaCl的O.5％淀粉液(m1)

222稀唾液1：50(m1)111立即處理溫度0℃100℃37

℃

放置15min分別從l、2、3支試管中取出一滴在白瓷板上用碘液檢驗結(jié)果

改變處理溫度至

37℃37℃37℃作用時間

15min再分別從1、2、3管中取出一滴在白瓷板上用碘液檢驗結(jié)果

目前四十九頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點(三)酶濃度對酶活性的影響1．取3支潔凈試管，編號，按表4加入淀粉液，緩沖液，加畢后放人37℃恒溫水浴中保溫5min。表4酶濃度對酶活性的影響

管號

含NaCl的O．5％淀粉液

pH6.8的緩沖液

稀釋唾液

褪色時間

105010013ml

2ml

1ml23ml

2ml1ml33ml

2ml1ml目前五十頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點2．保溫后，快速加不同濃度的稀釋唾液，搖勻，立即放入37℃恒溫水浴中。計時，并每隔1min從各管中取出1滴，用碘液檢驗，記錄從加進酶液至碘液檢驗為橙黃色所需時間。目前五十一頁\總數(shù)五十九頁\編于二十一點(四)離子對酶活性的影響取3支潔凈試管，編號后按表5操作：表5離子對酶活性的影響管號

1231％NaCl(m1)