實(shí)驗(yàn)四PCR產(chǎn)物的T載體克隆和轉(zhuǎn)化

實(shí)驗(yàn)四PCR產(chǎn)物的T載體克隆和轉(zhuǎn)化演示文稿目前一頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)優(yōu)選實(shí)驗(yàn)四PCR產(chǎn)物的T載體克隆和轉(zhuǎn)化ppt目前二頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)重組DNA技術(shù)操作步驟目前三頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)基本原理目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá)

目前四頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)主要步驟：①制備目的基因和選擇相關(guān)載體②目的基因和有關(guān)載體進(jìn)行連接③重組的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞④DNA重組體的篩選和鑒定⑤DNA重組體的擴(kuò)增、表達(dá)和其他研究目前五頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)以質(zhì)粒為載體的DNA克隆過(guò)程目前六頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（三）PCR擴(kuò)增特定基因（四）人工合成一、目的基因的獲得——分（一）從基因組文庫(kù)中獲得

（二）從cDNA文庫(kù)中獲得目前七頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)組織或細(xì)胞染色體DNA基因片斷克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性內(nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫(kù)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合從基因組DNA文庫(kù)獲取目的基因目前八頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)限制酶切位點(diǎn)限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應(yīng)體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫(kù)用隨機(jī)切割的真核生物染色體DNA片段構(gòu)建基因文庫(kù)目前九頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)mRNAcDNA

雙鏈cDNA重組DNA分子cDNA文庫(kù)

反轉(zhuǎn)錄酶載體受體菌復(fù)制從cDNA文庫(kù)獲取目的基因逆轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT目前十頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序列。目前十一頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)幾種常用克隆載體的比較注：+表示可用；-表示不可用比較內(nèi)容質(zhì)粒λ噬菌體黏性質(zhì)粒M13噬菌體克隆容量<10kb<22kb40～50kb<1kb基因組DNA文庫(kù)-++-cDNA文庫(kù)++--亞克隆+--+序列分析++-+E.coli表達(dá)++--二、載體的選擇與準(zhǔn)備——選目前十二頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)三、DNA分子的體外連接——接（一）黏性末端（二）人工接頭的使用（三）加入同聚體尾（四）平端連接目前十三頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（一）黏性末端目前十四頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（二）人工接頭目前十五頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（三）加入同聚體尾待克隆DNA片段重組質(zhì)?；旌?、退火空白質(zhì)粒目前十六頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（四）平端連接目前十七頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′3′A(A)nA

A(A)nA

λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體5′3′5′目前十八頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)四、外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞——轉(zhuǎn)受體菌條件：安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

導(dǎo)入方式：轉(zhuǎn)化(transformation)轉(zhuǎn)染(transfection)感染(infection)目前十九頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)

外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞后，篩選含有目的基因的陽(yáng)性克隆并加以擴(kuò)增。所用的方法主要有遺傳學(xué)方法、免疫學(xué)方法、核酸雜交法、PCR等。五、目的基因的篩選和鑒定——篩目前二十頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)1.借助載體上的遺傳標(biāo)志進(jìn)行篩選

(1)利用抗生素抗性標(biāo)志篩選(2)利用基因的插入失活/插入表達(dá)特性篩選(3)利用標(biāo)志補(bǔ)救篩選(4)利用噬菌體的包裝特性進(jìn)行篩選2.序列特異性篩選

(1)RE酶切法(2)PCR法(3)核酸雜交法(4)DNA測(cè)序法

目前二十一頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)（一）

遺傳學(xué)方法1.插入滅活法目前二十二頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)插入失活篩選帶有重組載體的克隆目前二十三頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)目前二十四頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)2.藍(lán)-白篩選（α互補(bǔ)）許多載體（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）都含有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和氨基端145個(gè)氨基酸的編碼序列。這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)。這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶羧基端部分序列的宿主細(xì)胞。宿主和載體編碼的片段各自均無(wú)酶活性，但它們可以互補(bǔ)形成具有活性的β-半乳糖苷酶，使人工底物X-gal轉(zhuǎn)化成藍(lán)色的代謝產(chǎn)物，出現(xiàn)藍(lán)色的菌落。如果在多克隆位點(diǎn)上插入外源DNA片段，將使lacZ基因滅活，不能生成有活性的β-半乳糖苷酶，結(jié)果菌落呈現(xiàn)白色。目前二十五頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)α互補(bǔ)篩選（藍(lán)-白篩選）目前二十六頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)目前二十七頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)PCR產(chǎn)物的T載體

克隆和轉(zhuǎn)化

目前二十八頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/p>

學(xué)習(xí)T載體的特點(diǎn)和PCR產(chǎn)物的克隆方法。實(shí)驗(yàn)要求：

掌握利用T載體克隆PCR產(chǎn)物的方法；復(fù)習(xí)連接實(shí)驗(yàn)流程。技術(shù)應(yīng)用：

目的基因片段與T載體DNA連接，達(dá)到克隆基因的目的。目前二十九頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)材料：目的基因片段（回收的PCR產(chǎn)物）藥品：pEMGT-Vector(Promega公司)目前三十頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)

質(zhì)粒（plasmid）是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。大小約為數(shù)千堿基對(duì)。常有1~3個(gè)抗藥性基因，以利于篩選。目前三十一頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)質(zhì)粒載體克隆的質(zhì)粒載體允許外源的DNA插入，儲(chǔ)存。主要是DNA水平上的操作?；虮磉_(dá)的質(zhì)粒載體

允許外源DNA的插入、儲(chǔ)存和表達(dá)。目前三十二頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)目前三十三頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\編于二點(diǎn)實(shí)驗(yàn)原理普通Taq酶會(huì)在3′末端加一個(gè)A，這樣所有PCR產(chǎn)物都會(huì)在雙鏈DNA的3′端均有一個(gè)單鏈狀態(tài)的A；T-載體是線狀DNA片段，在DNA雙鏈的3′端均有一個(gè)單鏈狀態(tài)的T；二者在連接酶的作用下連接為一個(gè)重組的環(huán)狀分子，從而達(dá)到克隆的目的。目前三十四頁(yè)\總數(shù)三十八頁(yè)\