DNA重組技術(shù)的基本工具

專題1基因工程1.1DNA重組技術(shù)的基本工具抗蟲棉普通棉基因工程的產(chǎn)物轉(zhuǎn)基因抗蟲棉基因工程的產(chǎn)物基因工程的產(chǎn)物基因工程的產(chǎn)物奇思妙想奇思妙想什么叫基因工程？

基因工程，又叫DNA重組技術(shù)。通俗的說，就是按照人們的意愿，把一種生物的某種基因提取出來，加以修飾改造，然后放到另一種生物的細(xì)胞里，定向地改造生物的遺傳特性。問題探討：蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。讓細(xì)菌的毒蛋白基因在棉花細(xì)胞中表達(dá)，可培育出抵抗棉鈴蟲害的抗蟲棉。

想一想需要做哪些關(guān)鍵工作？蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲棉基因工程培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合”關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因進(jìn)入棉花細(xì)胞解決培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟需要哪些工具？“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶“分子縫合針”——DNA連接酶“分子運(yùn)輸車”——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體1.1、DNA重組技術(shù)的基本工具一、“分子手術(shù)刀”——限制性核酸內(nèi)切酶1.來源:主要從原核生物中分離純化

原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中能切割外源DNA、使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。2.作用:識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列,并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。磷酸二酯鍵1234512345限制酶的種類與命名

現(xiàn)在已經(jīng)從約300種微生物中分離出了約4000種限制性內(nèi)切酶(限制酶)。EcoRⅠ大腸桿菌（EscherichiacoliR）SmaⅠ粘質(zhì)沙雷氏桿菌（Serratiamarcesens）限制酶的識(shí)別序列…GAATTC……CTTAAG……CCCGGG……GGGCCC…EcoRⅠSmaⅠ

限制酶所識(shí)別的序列，無論是6個(gè)堿基還是4個(gè)堿基，都可以找到一條中軸線（如圖），中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ、重復(fù)排列的。當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開時(shí)，產(chǎn)生的是平末端。當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線兩側(cè)切開時(shí)，產(chǎn)生的是黏性末端。3.限制酶的作用結(jié)果：

被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，它們之間正好互補(bǔ)配對(duì)，這樣的切口叫黏性末端。

EcoRⅠ黏性末端黏性末端AATTCGTTAAGCSmaⅠ平末端平末端二、“分子縫合針”

——DNA連接酶1、作用:

把切下來的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸連接起來.2、作用原理：催化磷酸二酯鍵形成3、種類：E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶

可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶即恢復(fù)被限制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵

T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低T4DNA連接酶類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點(diǎn)差別DNA聚合酶DNA連接酶區(qū)別1區(qū)別2相同點(diǎn)DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?1)只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵1)在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵2)以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過磷酸二酯鍵連接成一條互補(bǔ)的DNA鏈2)將DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來，不需要模板常用的載體：質(zhì)粒能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制有切割位點(diǎn)有標(biāo)記基因的存在，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基鑒別三、“分子運(yùn)輸車”——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體⒈載體需要的條件：

（1）有1至多個(gè)限制酶切點(diǎn)（2）能在受體細(xì)胞中能自主復(fù)制（3）有某些標(biāo)記基因，便于鑒定和選擇（4）對(duì)受體細(xì)胞無害（5）分子大小適合，以便提取和體外操作三、“分子運(yùn)輸車”——基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體在進(jìn)行基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的。

（1）細(xì)菌的質(zhì)粒（2）λ噬菌體的衍生物

（3）動(dòng)植物病毒⒉常用運(yùn)載體：（1）將外源基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去。（2）利用運(yùn)載體在受體細(xì)胞內(nèi)，對(duì)外源基因進(jìn)行大量復(fù)制。3、載體的作用：……ATAGCATGCTATCCATG……TATCGTACGATAGGTACTTAAAATTCGGCATAC……GCCGTATG…………TCCTAG……AGGATCTTAAAATTCCATAC……GGTATG……AATTCTCGGTATGGAGCCATACTTAA27483615思考與探究P7思考與探究P72、為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？

通過長期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識(shí)別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識(shí)別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會(huì)使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？提示：基因工程中作為載體使用的DNA分子很多都是質(zhì)粒（plasmid），即獨(dú)立于細(xì)菌擬核染色體DNA之外的一種可以自我復(fù)制、雙鏈閉環(huán)的裸露的DNA分子。是否任何質(zhì)粒都可以作為基因工程載體使用呢？不是，作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件：思考與探究P71）載體DNA必需有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點(diǎn)所處的位置，還必須是在質(zhì)粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。2）載體DNA必需具備自我復(fù)制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。3）載體DNA必需帶有標(biāo)記基因，以便重組后進(jìn)行重組子的篩選。4）載體DNA必需是安全的，不會(huì)對(duì)受體細(xì)胞有害，或不能進(jìn)入到除受體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去。5）載體DNA分子大小應(yīng)適合，以便提取和在體外進(jìn)行操作，太大就不便操作。