技術(shù)原理及實(shí)驗(yàn)操作詳解

技術(shù)原理及實(shí)驗(yàn)操作年詳解演示文稿目前一頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)優(yōu)選技術(shù)原理及實(shí)驗(yàn)操作年目前二頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)一、PCR的基本原理和步驟基本原理－DNA復(fù)制堿基互補(bǔ)配對(duì)原則A=T，G=C目前三頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)一級(jí)結(jié)構(gòu)的文字式縮寫(xiě)基因TGCAGGTTAAAGG它的互補(bǔ)鏈:ACGTCCAATTTCC(誤)CCTTTAACCTGCA(正)3’-ACGTCCAATTTCC-5’(正)A—TG—CAAA-TA-TA—TC—GC—GG—CG—CA—TTTA—TG—CC—GA-TA-TA—TC—GG—CG—CA-TA—TG—CT—AC—GT—AA-TA-TA—TC—GG—CG-C目前四頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)二、PCR的成分

模板（TemplateDNA）引物（Primer）

TaqDNA聚合酶

dNTP

Taq聚合酶緩沖液（TaqBuffer）

所有成分在同一離心管中目前五頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)模板是一段單鏈或者雙鏈DNA，提供用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增的原始信息對(duì)模板的純度要求低，但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白等模板濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增加模板DNA應(yīng)該盡量保持低溫保存目前六頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)引物一段短的單鏈DNA片段，可結(jié)合在核酸鏈上與之互補(bǔ)的區(qū)域，其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點(diǎn)，DNA聚合酶可由其3′端開(kāi)始合成新的核酸鏈引物濃度過(guò)高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配，反應(yīng)特異性下降

；濃度過(guò)低產(chǎn)物量少目前七頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)TaqDNA聚合酶

以DNA為復(fù)制模板，從將DNA由5'端點(diǎn)開(kāi)始復(fù)制到3'端的酶。DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具備模板、引物、dNTP等的情況下）及其相輔的活性。必須一直保存于－20℃，內(nèi)含甘油保存最適反應(yīng)溫度72℃，即延伸溫度在配制PCR體系的最后加入酶量增加使反應(yīng)特異性下降；酶量過(guò)少影響反應(yīng)產(chǎn)量目前八頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)dNTP脫氧核糖核苷三磷酸的縮寫(xiě)，是包括dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dUTP等在內(nèi)的統(tǒng)稱，即合成新的DNA鏈的材料4種dNTP

的濃度相等濃度過(guò)高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入，濃度過(guò)低則降低反應(yīng)產(chǎn)量目前九頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)Buffer

維持Taq酶擴(kuò)增的最適條件和穩(wěn)定性Mg2+是TaqDNA聚合酶的激活劑過(guò)高:非特異擴(kuò)增增加

過(guò)低:使Taq酶活性喪失，反應(yīng)產(chǎn)物減少目前十頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)注意事項(xiàng)所有的PCR體系都應(yīng)該在-20℃保存除了ddH2O之外，完全融化之后再加入，以免影響濃度配制反應(yīng)體系應(yīng)在冰上操作或快速進(jìn)行，以減少非特異性擴(kuò)增體系配制完成之后應(yīng)馬上進(jìn)行PCR反應(yīng)分裝處理，專人專用，防止交互污染目前十一頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)三、PCR的步驟目前十二頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)三個(gè)步驟

變性(denaturation)-高溫下將模板DNA雙鏈打開(kāi)

退火(annealing)-引物在較低溫度下以共價(jià)鍵結(jié)合到模板DNA互補(bǔ)部位

延伸(extension)-Taq酶作用下，不斷向引物3’端添加DNTP，DNA鏈不斷延伸反應(yīng)液中含有所有成分，以溫度變化來(lái)控制反應(yīng)階段：變性94度，退火58度，延伸72度。目前十三頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍目前十四頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃變性第一輪擴(kuò)增目前十五頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)58℃引物1引物2DNA引物退火目前十六頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶延伸目前十七頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)第1輪結(jié)束95℃第2輪開(kāi)始目前十八頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)50℃TaqTaqTaqTaq72℃目前十九頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束目前二十頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增目前二十一頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)PCR的特點(diǎn)PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)靈敏度高皮克(pg=10-12)量級(jí)擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞病毒檢測(cè)的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU細(xì)菌檢測(cè)的最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌簡(jiǎn)便、快速一次性加好反應(yīng)液，2～4小時(shí)完成擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對(duì)標(biāo)本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNA目前二十二頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)PCR的反應(yīng)體系目前二十三頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系

10X擴(kuò)增緩沖液：5μl模板DNA:0.1~2μg

引物：各0.2~1μmol/L4種dNTP:各200μmol/LMg2+:1.5mmol/LTaqDNA聚合酶：2.5UddH2O補(bǔ)齊

總體積：50μl可以按照比例放大或者縮小體系，不同的PCR反應(yīng)需要優(yōu)化按照實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行即可目前二十四頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)PCR實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)除實(shí)驗(yàn)樣品外，每個(gè)PCR反應(yīng)都必須有陽(yáng)性和陰性對(duì)照-針對(duì)模板陽(yáng)性：驗(yàn)證PCR反應(yīng)體系和條件的正確性陰性：驗(yàn)證PCR反應(yīng)有無(wú)污染目前二十五頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)PCR循環(huán)參數(shù)94℃，3min；

94℃，45s；

58℃，1min；循環(huán)30次

72℃，1min；

72℃，10min；

16℃保溫（熱力學(xué)參數(shù)）目前二十六頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍目前二十七頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)94℃，3min；

94℃，45s；

58℃，1min；循環(huán)30次

72℃，1min；

72℃，10min；

16℃保溫

94℃預(yù)變性，3min

使DNA雙鏈完全打開(kāi)退火：58℃，1min

溫度由引物長(zhǎng)度和GC含量決定。

增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合，降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。變性：94℃變性，45s

使雙鏈DNA解鏈為單鏈延伸：72℃，1min

溫度為T(mén)aq酶最適反應(yīng)溫度72℃

時(shí)間由擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度決定1min擴(kuò)增1KB

目前二十八頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)循環(huán)次數(shù)：

主要取決于模板DNA的濃度

次數(shù)過(guò)多：擴(kuò)增效率降低

錯(cuò)誤摻入率增加目前二十九頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)第二節(jié)凝膠電泳

(gelelectrophoresis)電泳概念基本原理Qμ＝

6πrη

μ:遷移率

Q:電荷量

r:粒子半徑（分子量）η:介質(zhì)粘度

目前三十頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)電泳的用途分離鑒定純度測(cè)定分子量凝膠電泳的種類(lèi)瓊脂糖凝膠電泳()

聚丙烯酰胺凝膠電泳

目前三十一頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳

(agarosegelelectrophoresis)

分離核酸原理操作要點(diǎn)應(yīng)用范圍目前三十二頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)（一）分離核酸原理

電荷效應(yīng)

分子篩效應(yīng)

分子構(gòu)象目前三十三頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)1.電荷效應(yīng)核酸是兩性電解質(zhì)

pH=3.5,正電荷pH=8.0~8.3

,負(fù)電荷，向正極移動(dòng)在電泳緩沖液中，DNA帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)作用下向正極移動(dòng)電泳不能使用蒸餾水，必須使用電泳緩沖液目前三十四頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)2.分子篩效應(yīng)小分子移動(dòng)快，大分子移動(dòng)慢目前三十五頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)3.分子構(gòu)象閉環(huán)超螺旋>線狀DNA>開(kāi)環(huán)DNA

+-目前三十六頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)（二）操作要點(diǎn)支持物凝膠濃度的選擇

DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)電泳緩沖液樣品制備電泳條件

DNA電泳染色目前三十七頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)1.支持物-瓊脂糖瓊脂糖是由1，3連接的B-D-半乳呋喃糖和1，4連接的3，6脫水α-L-半乳呋喃糖相間聯(lián)結(jié)而成。瓊脂中除瓊脂糖外，尚含有瓊脂糖果膠(Agaropectin)和丙酮酸等帶電荷基團(tuán)分子，在瓊脂糖制備過(guò)程中盡可能地去除掉這些帶電荷分子，以便獲得品質(zhì)優(yōu)良的電荷中性產(chǎn)品。目前三十八頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)商品化的瓊脂糖西班牙瓊脂糖agrose與細(xì)菌培養(yǎng)用瓊脂agar的區(qū)別目前三十九頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)2.凝膠濃度的選擇目前四十頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)凝膠的制備注意：使用電泳緩沖液進(jìn)行配制；加熱過(guò)程中要不時(shí)搖動(dòng)，使附著于壁上的瓊脂糖顆粒進(jìn)入溶液溶解。目前四十一頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)目前四十二頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)3.DNAmarker上樣3μl，750bp條帶為50ng，其它25ng上樣3μl，500bp條帶為50ng，其它25ng目前四十三頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)DNA長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線目前四十四頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)4.電泳緩沖液

Tris-乙酸(TAE)pH8.0

Tris-硼酸(TBE)pH8.0

Tris-磷酸(TPE)pH8.0凝膠制備時(shí)一定要使用電泳緩沖液

目前四十五頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)5.樣品制備DNA樣品每條帶>100ng上樣緩沖液50%甘油/蔗糖0.5%溴酚藍(lán)/二甲苯青作用：上色；沉降

目前四十六頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)點(diǎn)樣目前四十七頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)目前四十八頁(yè)\總數(shù)五十六頁(yè)\編于二十三點(diǎn)6.電泳條件恒壓電泳

低壓:1~2V/cm

中壓:8~10V/cm