細(xì)胞增殖調(diào)控

細(xì)胞增殖調(diào)控第一頁，共55頁。一、MPF的發(fā)現(xiàn)及其作用MPF（maturation-/mitosis-/M-phase-promotingfactor）：即（卵細(xì)胞）成熟促進(jìn)因子，或細(xì)胞有絲分裂促進(jìn)因子，也稱M期促進(jìn)因子，在細(xì)胞周期調(diào)控中起重要作用。PCC（prematurechromosomecondensation）：即早熟染色體凝縮，主要是指與M期細(xì)胞融合的間期細(xì)胞（G1、S和G2）發(fā)生的形態(tài)各異的染色體凝縮。G1期PCC為細(xì)單線狀（因DNA未復(fù)制），S期PCC為粉末狀（因DNA由多個(gè)部位開始復(fù)制），G2期PCC為雙線染色體狀（說明DNA復(fù)制已完成），這樣的形態(tài)變化可能與DNA復(fù)制狀態(tài)有關(guān)。第二頁，共55頁。一、MPF的發(fā)現(xiàn)及其作用M期細(xì)胞中可能存在細(xì)胞有絲分裂促進(jìn)因子：M期細(xì)胞可以誘導(dǎo)PCC，暗示在M期細(xì)胞中可能存在一種誘導(dǎo)染色體凝縮的因子，稱為細(xì)胞有絲分裂促進(jìn)因子（MPF）。第三頁，共55頁。M期細(xì)胞與G1（A）、S（B）和G2（C）期細(xì)胞融合誘導(dǎo)早熟染色體凝縮（PCC）（圖14-1）第四頁，共55頁。成熟卵細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)移植發(fā)現(xiàn)成熟促進(jìn)因子的存在：兩位科學(xué)家分離出第Ⅳ期等待成熟的非洲爪蟾卵母細(xì)胞，并用孕酮進(jìn)行體外刺激，誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟，然后進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)移植實(shí)驗(yàn)，他們發(fā)現(xiàn)，在成熟的卵細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中必然有一種物質(zhì)可以誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟，即成熟促進(jìn)因子（MPF）；后來還證明，在成熟卵細(xì)胞中，MPF已經(jīng)存在，只需通過翻譯后修飾即可轉(zhuǎn)化為活性狀態(tài)的MPF。1998年分離獲得了MPF：1998年，科學(xué)家們以非洲爪蟾卵為材料，分離獲得了微克級(jí)的純化MPF，并證明其主要含有p32和p45兩種蛋白，并且是一種蛋白激酶。第五頁，共55頁。非洲爪蟾卵細(xì)胞成熟過程（Ⅰ~Ⅵ）、受精和第一次卵裂示意圖（圖14-2）第六頁，共55頁。成熟卵細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)移植發(fā)現(xiàn)成熟促進(jìn)因子（MPF）的存在（圖14-3）第七頁，共55頁。二、p34cdc2激酶的發(fā)現(xiàn)及其與MPF的關(guān)系（已知）非洲爪蟾卵：MPF＝p32

＋p45；MPF是激酶裂殖酵母：cdc2（基因）→p34cdc2（蛋白）p34cdc2激酶→調(diào)控G2/M轉(zhuǎn)換；p34cdc2

＋p56cdc13。cdc即細(xì)胞分裂周期之縮寫。芽殖酵母：cdc28（基因）→p34cdc28（蛋白）p34cdc28激酶→調(diào)控G1/S和G2/M轉(zhuǎn)換；p34cdc28≈p34cdc2（同源物）。

p34cdc2≈p32（同源物）。海膽卵：含量隨細(xì)胞周期進(jìn)程變化而變化的蛋白質(zhì)即周期蛋白（cyclin），cyclinB是MPF的另一種主要成分；cyclinB≈p56cdc13（同源物）。結(jié)論：MPF＝催化亞基單位（CDK）＋調(diào)節(jié)亞單位（Cyclin）。CDK為周期蛋白（cyclin）依賴性蛋白激酶第八頁，共55頁。三、周期蛋白周期蛋白（cyclin）：指含量隨細(xì)胞周期進(jìn)程變化而周期性變化的蛋白質(zhì)，一般在細(xì)胞間期內(nèi)積累，在細(xì)胞分裂期內(nèi)消失，在下一個(gè)細(xì)胞周期中又重復(fù)這一消長(zhǎng)現(xiàn)象。周期蛋白有多種：酵母中的周期蛋白有Cln1~3、Clb1~6；哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的周期蛋白A1~2、B1~3、C、D1~3、E1~2、F、G、H、L1~2、T1~2等。周期蛋白框（cyclinbox）：指所有周期蛋白中都存在的約由100個(gè)殘基組成的相當(dāng)保守的氨基酸序列，其功能是介導(dǎo)周期蛋白與CDK結(jié)合。第九頁，共55頁。三、周期蛋白破壞框/降解盒（destructionbox）：指M期周期蛋白近N端含有的一段由9個(gè)氨基酸殘基組成的特殊序列（RXXLGXIGX），其功能是參與泛素依賴性的cyclinA和B的降解。在破壞框之后有一段約40個(gè)氨基酸殘基組成的Lys（K）富集區(qū)。PEST序列：指G1期周期蛋白的C端含有的一段特殊的PEST氨基酸序列，其功能可能與G1期周期蛋白的更新（降解）有關(guān)。不同的Cyclin-CDK復(fù)合體表現(xiàn)不同的CDK活性：不同的周期蛋白在細(xì)胞周期中表達(dá)的時(shí)相不同，并通過不同的周期蛋白框與不同的CDK結(jié)合，組成不同的cyclin-CDK復(fù)合體，表現(xiàn)出不同的CDK活性。第十頁，共55頁。周期蛋白含量隨細(xì)胞周期的變化第十一頁，共55頁。部分周期蛋白分子結(jié)構(gòu)特征（圖14-4）第十二頁，共55頁。細(xì)胞周期蛋白的降解盒與降解途徑第十三頁，共55頁。部分哺乳動(dòng)物（A）和酵母細(xì)胞（B牙殖和C裂殖）周期蛋白在細(xì)胞周期中的積累及其與CDK活性的關(guān)系（圖14-5）第十四頁，共55頁。四、CDK和CDK抑制因子周期蛋白依賴性蛋白激酶（cyclin-dependentkinase,CDK）：由周期蛋白結(jié)合并活化的調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程的蛋白激酶。CDK通過磷酸化其底物而對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)控。CDK有多種：在人體中發(fā)現(xiàn)并命名的CDK包括CDK1（Cdc2）~CDK13。不同的CDK在細(xì)胞周期中起調(diào)節(jié)作用的時(shí)期不同。某些CDK與cyclin的配對(duì)關(guān)系及執(zhí)行的功能的時(shí)期：見表14-1。CDK激酶結(jié)構(gòu)域：各種CDK的CDK激酶結(jié)構(gòu)域保守程度有所不同，但其中有一小段序列則相當(dāng)保守，即PSTAIRE序列，與周期蛋白結(jié)合有關(guān)。第十五頁，共55頁。四、CDK和CDK抑制因子CDK的活性受磷酸化修飾調(diào)節(jié)：細(xì)胞內(nèi)存在多種因子，對(duì)CDK分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行磷酸化修飾，從而調(diào)節(jié)CDK的活性。CDK抑制蛋白（CDKinhibitor,CKI）：指對(duì)CDK起負(fù)調(diào)控作用的蛋白質(zhì)，包括Cip/Kip家族和INK家族。①Cip/Kip家族：包括p21、p27和p57等，其中p21主要對(duì)G1期CDK（CDK2~4和CDK6）起抑制作用p21還與DNA聚合酶δ的輔助因子增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）結(jié)合，抑制DNA的復(fù)制；②INK家族：包括p16、p15、p18和p19等，其中p16主要抑制CDK4和CDK6活性。第十六頁，共55頁。通過PCR技術(shù)測(cè)定與CDK1類似的CDK蛋白分子圖解（圖14-6）第十七頁，共55頁。第十八頁，共55頁。不同類型的周期蛋白激酶復(fù)合體脊椎動(dòng)物芽殖酵母CyclinCDKCyclinCDKG1-CDKCyclinD*CDK2、4

、6Cln3CDK1(CDC28)G1/S-CDKCyclinECDK2Cln1、2CDK1(CDC28)S-CDKCyclinACDK2Clb5、6CDK1(CDC28)G2/M-CDKCyclinBCDK1(CDC2)Clb1-4CDK1(CDC28)第十九頁，共55頁。周期蛋白-周期蛋白依賴型激酶復(fù)合物在真核生物細(xì)胞周期調(diào)控中的作用

真核生物周期蛋白-周期蛋白依賴型激酶復(fù)合物在細(xì)胞周期調(diào)控中的作用G1G1-SSG2-M芽殖酵母Cln3-CDC28Cln1/2-CDC28Clb5/6-CDC28Clb1-4-CDC28裂殖酵母Cig1-CDC2Cig2-CDC2Cig2-CDC2Cdc13-CDC2脊椎動(dòng)物CycD-CDK4/6CycE-CDK2CycA-CDK2CycA/B-CDK1植物CycD-CDKACycA-CDKACycA-CDKACycA/B-CDKACDC:細(xì)胞分裂周期蛋白第二十頁，共55頁。Cyclin的周期性變化第二十一頁，共55頁。植物細(xì)胞周期控制的圖示

第二十二頁，共55頁。p21抑制作用的機(jī)理

第二十三頁，共55頁。五、細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)調(diào)控

細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)（cellcyclecontrolsystem）是指調(diào)節(jié)細(xì)胞周期運(yùn)行的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)。CDK因?qū)?xì)胞周期運(yùn)行起著核心調(diào)控作用而被稱為周期引擎分子。不同種類的周期蛋白與不同種類的CDK結(jié)合，構(gòu)成不同的MPF。不同的MPF在細(xì)胞周期的不同時(shí)期表現(xiàn)活性，因而對(duì)細(xì)胞周期的不同時(shí)期進(jìn)行調(diào)節(jié)。MPF又被稱作細(xì)胞周期引擎。（一）G2/M期轉(zhuǎn)化與CDK1的關(guān)鍵性調(diào)控作用（二）M期周期蛋白與細(xì)胞分裂中期向后期轉(zhuǎn)化（三）G1/S期轉(zhuǎn)化與G1期周期蛋白依賴性CDK

（四）S/G2/M期轉(zhuǎn)換與DNA復(fù)制檢查點(diǎn)第二十四頁，共55頁。（一）G2/M期轉(zhuǎn)化與CDK1的關(guān)鍵性調(diào)控作用CDK1活性依賴于cyclinB含量的積累：cyclinB（或cyclinA）的含量達(dá)到一定值并與CDK1結(jié)合，同時(shí)在其它一些因素的調(diào)節(jié)下，逐漸表現(xiàn)出最高激酶活性（G2/M期轉(zhuǎn)換和M期啟動(dòng)）。CDK1催化底物蛋白磷酸化：CDK1通過使某些底物蛋白磷酸化，改變其下游的某些靶蛋白的結(jié)構(gòu)和啟動(dòng)其功能，實(shí)現(xiàn)其調(diào)控細(xì)胞周期的作用。CDK1選擇底物中某個(gè)特定序列中的某個(gè)Ser/Thr殘基磷酸化。CDK1可以使多種底物蛋白磷酸化（見表14-2）。第二十五頁，共55頁。（一）G2/M期轉(zhuǎn)化與CDK1的關(guān)鍵性調(diào)控作用CDK活性受到多種因素的綜合調(diào)節(jié)：①周期蛋白與CDK結(jié)合只是激活CDK活性的先決條件：僅周期蛋白與CDK結(jié)合，并不能使CDK激活；②還需要其它幾個(gè)步驟的修飾：cyclinB-CDK1復(fù)合物（無活性）→Wee1/mik1激酶和CDK1活化激酶（CAK）→cyclinB-CDK1的Thr14、Tyr15和Thr161磷酸化（無活性前體MPF）→cdc25C蛋白磷酸酶→cyclinB-CDK1僅剩Thr161磷酸化（有激酶活性的MPF）（MPF對(duì)cdc25C有正反饋?zhàn)饔茫┎煌腃DK之間有一定的代償功能；CDK對(duì)個(gè)體和器官的發(fā)育也起著重要的調(diào)節(jié)作用。第二十六頁，共55頁。cyclinB在CDK1活性調(diào)節(jié)過程中的作用（圖14-7）第二十七頁，共55頁。第二十八頁，共55頁。CDK1激酶活性綜合控制示意圖（圖14-8）第二十九頁，共55頁?；钚訫PF的正反饋第三十頁，共55頁。（二）M期周期蛋白與細(xì)胞分裂中期向后期轉(zhuǎn)化后期促進(jìn)復(fù)合物（anaphase-promotingcomplex，APC）：20S，泛素連接酶（E3），通過泛素依賴性蛋白降解途徑，降解M期周期蛋白和中期向后期轉(zhuǎn)換的非周期蛋白類負(fù)調(diào)控因子，使細(xì)胞從中期向后期轉(zhuǎn)換。APC至少由15種成分組成，分別稱為APC1~APC15。APC的發(fā)現(xiàn)是細(xì)胞周期研究領(lǐng)域中又一重大進(jìn)展，表明細(xì)胞分裂中期向后期轉(zhuǎn)換也受到精密調(diào)控。APC的主要作用：到達(dá)分裂中期后，cyclinB/A與CDK1分離，在APC介導(dǎo)下，通過泛素化依賴途徑而降解。CDK1活性消失，細(xì)胞由分裂中期向后期轉(zhuǎn)化。第三十一頁，共55頁。（二）M期周期蛋白與細(xì)胞分裂中期向后期轉(zhuǎn)化APC活性受到多種因素的綜合調(diào)節(jié)：①M(fèi)期CDK激酶和蛋白磷酸酶對(duì)APC的活性起著調(diào)節(jié)作用；②紡錘體組裝檢查點(diǎn)調(diào)控APC的活性，如cdc20和Mad2（有絲分裂捕獲缺陷蛋白2）分別為APC有效的正調(diào)控因子和負(fù)調(diào)控因子，在分裂中期之前，位于動(dòng)粒上的Mad2與cdc20結(jié)合并抑制其活性。到分裂中期，Mad2從動(dòng)粒上消失，解除對(duì)cdc20的抑制作用，促使APC活化，導(dǎo)致M期周期蛋白降解，M期CDK活性喪失。第三十二頁，共55頁。后期促進(jìn)復(fù)合物（APC）作為有絲分裂的終結(jié)者第三十三頁，共55頁。馬達(dá)蛋白和微管系統(tǒng)共同協(xié)作導(dǎo)致染色體分離第三十四頁，共55頁。CyclinB的降解途徑第三十五頁，共55頁。（三）G1/S期轉(zhuǎn)化與G1期周期蛋白依賴性CDK細(xì)胞由G1期向S期（G1/S期）轉(zhuǎn)化主要受G1期周期蛋白依賴性CDK：cyclinD-CDK4/6、cyclinE-CDK2和cyclinA-CDK2。cyclinD-CDK4/6為細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)化所必需：cyclinD包括D1、D2和D3，它們的表達(dá)有細(xì)胞和組織特異性；cyclinD-CDK4/6的底物主要是Rb蛋白（retinoblastomaprotein）即成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白，Rb蛋白是E2F的抑制因子，E2F是促進(jìn)與G1/S期轉(zhuǎn)化和DNA復(fù)制有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子，Rb蛋白在G1/S期轉(zhuǎn)化中起負(fù)調(diào)控（“剎車”）作用，在G1期的晚期通過磷酸化而失活。第三十六頁，共55頁。（三）G1/S期轉(zhuǎn)化與G1期周期蛋白依賴性CDKcyclinE-CDK2為S期啟動(dòng)所必需：cyclinE-CDK2的主要作用是去除p107（類Rb蛋白）對(duì)E2F的抑制作用，促進(jìn)G1/S期轉(zhuǎn)化；cyclinE-CDK2是TGF-β的主要靶酶，TGF-β可以有效地抑制cyclinE-CDK2活性，進(jìn)而將細(xì)胞阻止在G1期；cyclinE在腫瘤細(xì)胞中的含量比正常細(xì)胞中要高得多；在細(xì)胞中，提高cyclinE的表達(dá)，該細(xì)胞則快速進(jìn)入S期，對(duì)生長(zhǎng)因子的依賴性降低。cyclinA-CDK2也可以作用于p107（類Rb蛋白）：除此之外，cyclinA合成雖始于G1/S期轉(zhuǎn)化時(shí)期，但cyclinA-CDK2卻是S期主要的CDK。第三十七頁，共55頁。CyclinD與CDK結(jié)合使Rb釋放結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子E2F第三十八頁，共55頁。p53和Rb在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中的作用

第三十九頁，共55頁。G1期周期蛋白是到達(dá)S期的一定階段通過SCF泛素化途徑降解的，同時(shí)需要G1期CDK的參與：SCF（Skp-cullin-F-boxprotein）（間期初級(jí)活化因子）是一種具有泛素連接酶（E3）功能的多亞基的蛋白復(fù)合物（Skp1、Cul1和Rbx1），可以被Skp2、β-Trcp或Fbw7三種F-box蛋白分別活化，而且SCF的底物特異性的識(shí)別是由F-box蛋白來決定的；SCF通過降解細(xì)胞周期的不同時(shí)期的不同的底物從而在整個(gè)細(xì)胞周期中都發(fā)揮作用（但主要在細(xì)胞間期G1、S和G2期發(fā)揮作用），如降解①

G1期周期蛋白（cyclinA、D1和E）（PEST序列對(duì)降解起促進(jìn)作用），②CKI（p21、p27和p57），③DNA復(fù)制調(diào)控因子（ORC1和Cdt1）和④其它（cdc25a、Wee1和Emi1）。APC主要在M期和G1期早期發(fā)揮作用：APC的2個(gè)負(fù)責(zé)底物識(shí)別的因子是cdc20和Cdh1，APC催化的底物見圖14-9。第四十頁，共55頁。間期初級(jí)活化因子（SCF）和后期促進(jìn)復(fù)合物（APC）在細(xì)胞周期中的活動(dòng)第四十一頁，共55頁。APC和SCF在細(xì)胞周期中的活性及其底物（圖14-9）第四十二頁，共55頁。SCF泛素化依賴蛋白質(zhì)降解途徑（圖14-10）第四十三頁，共55頁。其它對(duì)DNA復(fù)制起始活動(dòng)進(jìn)行綜合調(diào)控的因素：DNA復(fù)制的起始并不僅僅是在G1期末的起始點(diǎn)（限制點(diǎn)）處才決定的。早在G1期開始時(shí)，許多與DNA復(fù)制有關(guān)的物質(zhì)即已表達(dá)并與染色質(zhì)結(jié)合，開始了DNA復(fù)制的起始調(diào)控。①ORC（復(fù)制起始點(diǎn)識(shí)別復(fù)合物）：ORC識(shí)別DNA復(fù)制起始點(diǎn)并與之結(jié)合，這是DNA復(fù)制起始所必需的；②cdc6和cdc45也是DNA復(fù)制所必需的調(diào)控因子：cdc6在G1期早期與染色質(zhì)結(jié)合，到S期早期從染色質(zhì)上解離下來；cdc45約在G1期晚期才與染色質(zhì)結(jié)合，CDK6對(duì)cdc45于染色質(zhì)的結(jié)合起促進(jìn)作用；第四十四頁，共55頁。③DNA復(fù)制執(zhí)照（licensing）因子—Mcm蛋白（minichromosomemantenanceprotein）：在M期，胞質(zhì)中的執(zhí)照因子Mcm蛋白（DNA解旋酶）與染色質(zhì)接觸并與之結(jié)合，使染色質(zhì)獲得DNA復(fù)制所必需的“執(zhí)照”，但隨著DNA復(fù)制進(jìn)程“執(zhí)照”信號(hào)會(huì)不斷減弱直到消失，只有等到下一個(gè)M期重新獲得“執(zhí)照”，才能開始新一輪的DNA復(fù)制。DNA復(fù)制起始調(diào)控是近十年細(xì)胞周期調(diào)控研究中的又一大進(jìn)展。第四十五頁，共55頁。ORC、cdc6、cdc45、CDK和Mcm與染色質(zhì)的結(jié)合及其在DNA復(fù)制起始調(diào)控中的作用（圖14-11）第四十六頁，共55頁。ORC、cdc6、cdc45、CDK和Mcm與染色質(zhì)的結(jié)合及其在DNA復(fù)制起始調(diào)控中的作用（圖14-11）第四十七頁，共55頁。（四）S/G2/M期轉(zhuǎn)換與DNA復(fù)制檢驗(yàn)點(diǎn)檢查點(diǎn)（checkpoint）：細(xì)胞周期的調(diào)控點(diǎn)，檢驗(yàn)細(xì)胞從一個(gè)周期時(shí)相進(jìn)入下一個(gè)時(shí)相的條件是否適合。除CDK及其直接的活性調(diào)節(jié)因子外，還有不少其他因素參與細(xì)胞周期調(diào)控過程，如各種檢查點(diǎn)等。各種檢查點(diǎn)也有專門的調(diào)控機(jī)制。第四十