小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)具體步驟及方法

小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)具體步驟及方法胚胎干細(xì)胞在體內(nèi)外可以分化為各種類型的細(xì)胞。我們的體外分化方法有利于神經(jīng)前體細(xì)胞通過在最少量的培養(yǎng)基內(nèi)選擇（第3步），在有bFGF存在的情況下擴(kuò)增（第4步）并最終分化在第5步。細(xì)胞全程培養(yǎng)在37℃,5%CO2,100%濕度條件下。一般體外誘導(dǎo)向神經(jīng)細(xì)胞方向分化，也可以采用低濃度的RA進(jìn)行誘導(dǎo)。具體步驟一、ES培養(yǎng)基在LIF存在的條件下維持細(xì)胞培養(yǎng)。二EB培養(yǎng)基使用細(xì)菌培養(yǎng)皿去除LIF后胚狀體的形成需要4天。.分散純化細(xì)胞（參見上面的細(xì)胞傳代部分）。.純化2小時(shí)后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入含有ES培養(yǎng)基的50mlFalcon管中，計(jì)數(shù)細(xì)胞取適量體積放入15ml管中離心3分鐘。.用2mlEB培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，吹打至少10次制成單細(xì)胞懸液.一個(gè)15cm的細(xì)菌培養(yǎng)皿接種4~5x106個(gè)細(xì)胞（1個(gè)完全融合的組織培養(yǎng)皿通常足以接種4個(gè)同樣規(guī)格的細(xì)菌培養(yǎng)皿）。.2天后更換培養(yǎng)基，將胚狀體轉(zhuǎn)入錐形管中放置3~5分鐘使細(xì)胞沉降。棄去上清，將細(xì)胞重懸于新鮮培養(yǎng)基并接種在新的細(xì)菌培養(yǎng)皿中。.用EB培養(yǎng)基培養(yǎng)的第4天將細(xì)胞轉(zhuǎn)入沒有包被的組織培養(yǎng)皿中（這即是細(xì)胞的移植步驟）。1個(gè)組織培養(yǎng)皿之中放置1個(gè)細(xì)菌培養(yǎng)皿，在進(jìn)行第3步之前一天將胚狀體黏附在同樣規(guī)格的培養(yǎng)板上。.形成胚狀體需要4天時(shí)間。在EB培養(yǎng)基中再培養(yǎng)1天使胚狀體粘附在組織培養(yǎng)皿的表面。這一天被認(rèn)為是第2步和第3步的分界。三、ITSFn培養(yǎng)基在最少量培養(yǎng)基中選擇神經(jīng)前體細(xì)胞.胚狀體接種在組織培養(yǎng)皿一天后將培養(yǎng)基換成ITSFn培養(yǎng)基。.并非所有胚狀體在這一時(shí)期都已經(jīng)發(fā)生粘附，因此在移除培養(yǎng)基時(shí)要小心謹(jǐn)慎以使大部分胚狀體留在培養(yǎng)皿內(nèi)。.保持細(xì)胞在ITSFn中培養(yǎng)大約10天，根據(jù)需要更換培養(yǎng)基--大約每隔一天。.觀察細(xì)胞形態(tài)，神經(jīng)樣細(xì)胞大約出現(xiàn)在第4到第7天。當(dāng)神經(jīng)樣細(xì)胞能夠被鑒別時(shí)，轉(zhuǎn)入到第4步。步驟的轉(zhuǎn)換應(yīng)該在神經(jīng)前體細(xì)胞出現(xiàn)第一個(gè)清晰的標(biāo)志幾天以后，通常是在第3步的第6到第10天。四、N3培養(yǎng)基+bFGF通過將神經(jīng)前體細(xì)胞培養(yǎng)在含有10ng/mlbFGF的培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增。.PBS洗滌，加入1-2ml胰酶。.37℃孵育5分鐘。.用4mlEB培養(yǎng)基終止胰酶活*，將細(xì)胞轉(zhuǎn)入錐形管中放置3~5分鐘移出細(xì)胞團(tuán)，將上清移入一新的離心管離心。.將細(xì)胞重懸于含有bFGF的N3培養(yǎng)基。.將細(xì)胞接種在包被多聚-L-鳥氨酸/纖維連接蛋白的蓋玻片上（最好將蓋玻片放于24孔培養(yǎng)板或6孔培養(yǎng)板，6孔培養(yǎng)板中每孔放置5個(gè)蓋玻片如果是塑料的放置4個(gè)，以使最大可能的獲得樣品數(shù)量）。24孔板接種3.5x105/孔或6孔板1.7x106/孔。6.26.2天后更換培養(yǎng)基。五、N3培養(yǎng)基通過撤除bFGF使神經(jīng)前體細(xì)胞分化。.細(xì)胞被接種在蓋玻片上4天后將培養(yǎng)基換成不含bFGF的N3培養(yǎng)基。.根據(jù)需要換液（大約每隔一天）。.分化10?15天后固定細(xì)胞。.移除培養(yǎng)基。.PBS洗滌，加入4%福爾馬林，室溫放置30分鐘，PBS洗滌2次儲(chǔ)存于PBS。.長(zhǎng)期儲(chǔ)存使用含0.01%疊氮化納的PBS。六、移植細(xì)胞的準(zhǔn)備細(xì)胞在胚狀體形成4天以后被移植（相應(yīng)于體外分化過程中的第2步末細(xì)胞被轉(zhuǎn)種到組織培養(yǎng)板）。正如在前文體外分化中所描述的在移植之前4天開始形成胚狀體。通常再需要一天時(shí)間以便將胚狀體移植入一10cm的培養(yǎng)皿。.將胚狀體轉(zhuǎn)移至一15ml圓錐形管中放置3~5分鐘使胚狀體沉降下來。細(xì)胞被離心3分鐘會(huì)更好。放置使之沉降將會(huì)去除更多的單個(gè)細(xì)胞（包括死細(xì)胞）而這些細(xì)胞可以被離心下來。.去除上清將胚狀體重懸于無(wú)鈣鎂離子的1xPBS中。.離心3分鐘。.去除上清加入1x胰酶（10cm的培養(yǎng)皿加1ml）。.37℃水浴5分鐘。.加入5mlEB培養(yǎng)基小心吹打約10次。.小心處理細(xì)胞很重要，進(jìn)行細(xì)胞傳代分散細(xì)胞時(shí)不可劇烈吹打。.離心2分鐘。.吸出上清將細(xì)胞重懸于500ulEB培養(yǎng)基。9.用光滑的巴斯德吸管小心吹打9.用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次。10.離心2次。11.吸出上清將細(xì)胞重懸于100ulEB培養(yǎng)基。七、煙酸已可堿標(biāo)記￡5細(xì)胞進(jìn)行移植.準(zhǔn)備一10ug/ml的煙酸已可堿染液（雙苯酰亞胺，在冷凍室118）。.加入1mg（你能稱到的最小量）到5mlEB培養(yǎng)基（制成200ug/ml）。.將溶液稀釋成10ug/ml（100ul200ug/ml溶液和1.9mlEB培養(yǎng)基）。.如前所述將細(xì)胞重懸于2ml煙酸已可堿染液而不是EB培養(yǎng)基中制備ES細(xì)胞懸液。.將懸液置于室溫（或冰上）30分鐘。.離心2分鐘。.吸出上清將細(xì)胞重懸于2mlEB培養(yǎng)基。.重復(fù)一次。.離心2分鐘。.吸出上清將細(xì)胞重懸于100ulEB培養(yǎng)基并置于冰上。注意.需要采用高純度的水進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞。.必須要在無(wú)菌的環(huán)境下操作實(shí)驗(yàn)。經(jīng)驗(yàn).在沒有添加LIF的條件下，培養(yǎng)在飼養(yǎng)層上的ES細(xì)胞克隆形成率和AKP染色陽(yáng)性度顯著高于無(wú)飼養(yǎng)層培