生化藥物知識點(diǎn)

生化藥物(BiochemicalDrugs)一、性質(zhì)生化藥物是從動物、植物及微生物中別離純化所得的，以及用化學(xué)合成、微生物合成或現(xiàn)代生物技術(shù)制得的生化根本物質(zhì)。生化藥物有兩個(gè)根本特點(diǎn)：其一，它來自生物體，X復(fù)雜，有些化學(xué)結(jié)構(gòu)不明確，分子量不是定值，多屬高分子物質(zhì)；其二，它是生物體中的根本生化成分。一、生化藥物的種類生化藥物按照化學(xué)本質(zhì)的不同，分為以下幾類：氨基酸及其衍生物類藥物包含天然氨基酸、氨基酸混合物和氨基酸衍生物。可由發(fā)酵制造，也可由蛋白水解制得。ChP(202X)二部收載的有門冬氨酸、色氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、亮氨酸、精氨酸、胱氨酸、脯氨酸等。多肽和蛋白類藥物這類藥物是人體內(nèi)的生理活性因子，在生物體內(nèi)，濃度很低，但活性很強(qiáng)。多肽參與調(diào)節(jié)生理功能，用于臨床的多肽有催產(chǎn)素〔9肽〕、加壓素〔9肽〕、胰高血糖素〔29肽〕、降鈣素〔9肽〕等。蛋白質(zhì)類藥物有水蛭素、魚精蛋白、胰島素、生長素、催乳素等。酶類與輔酶類藥物按其功能可分為：助消化酶類、蛋白水解酶類、凝血酶及抗栓酶、抗腫瘤酶類和其它酶類等；還包含局部輔酶類(輔酶Q)等。如胃蛋白酶、胰蛋白酶、玻璃酸酶、尿激酶、凝血酶、輔酶Q10等。糖類藥物包含肝素、硫酸軟骨素A和C、硫酸角質(zhì)素、透明質(zhì)酸等。類肝素(酸性粘多糖)、殼聚多糖、靈芝多糖、黃芪多糖、人參多糖、海藻多糖、螺旋藻粘多糖等。脂類藥物包含多價(jià)不飽和脂肪酸(PUFA)、磷脂類、固醇類'膽酸類和葉啉類。如亞油酸、卵磷脂、腦磷脂、膽固醇、血紅素、膽紅素等。核酸及其降解產(chǎn)物和衍生物類藥物包含核酸類、多聚核苷酸、核苷、核苷酸及其衍生物。例如免疫RNA、DNA(脫氧核糖核酸)、多聚胞苷酸、疏基聚胞苷酸、ATP和cAMP等。二、鑒別試驗(yàn)鑒別就是利用化學(xué)法、物理法及生物學(xué)方法來確證生化藥物的真?zhèn)?。通常，需用?biāo)準(zhǔn)品或?qū)Ρ绕吩谕粭l件下進(jìn)行對比試驗(yàn)?，F(xiàn)將常用的鑒別方法簡述如下?；瘜W(xué)反響法通常利用藥物與某試劑在肯定條件下反響，生成有顏色的產(chǎn)物或沉淀進(jìn)行鑒別。例如，溶菌酶的鑒別采納呈色法：溶菌酶分子中的四個(gè)肽鍵上的氮原子能與銅離子〔Cu2+〕絡(luò)合，生成有顏色的絡(luò)合物，肽鍵越多，產(chǎn)生的顏色越深。胃蛋白酶的鑒別采納沉淀法：胃蛋白酶是具有高效、專一催化活性的特別蛋白質(zhì)，易受酸、堿、重金屬或有機(jī)溶劑等的作用，破壞蛋白質(zhì)肽鏈的空間結(jié)構(gòu)，引起蛋白質(zhì)變性，生成不溶性的沉淀。紫外分光光度法三磷酸腺苷二鈉的分子中具有共軛系統(tǒng)，能汲取紫外光。本品的0.01mol/L鹽酸水溶液〔20|ig/ml〕，在〔257±1〕nm的波長處有最大汲取°A250nm/A260nm的值應(yīng)為0.17?0.27。酶法尿激酶是專屬性較強(qiáng)的蛋白水解酶，依據(jù)尿激酶能激活牛纖維蛋白溶酶原，而具有相同作用的鏈激酶不能激活牛纖維蛋白溶酶原而加以區(qū)別，并用直接觀察溶化纖維蛋白作用的氣泡上升法作為推斷指標(biāo)。電泳法肝素的鑒別采納糖凝膠電泳法：肝素是由D-硫酸氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子間組成的酸性粘多糖，其水溶液帶強(qiáng)負(fù)電荷，于瓊脂凝膠板上，在電場作用下，向正極方向移動，與肝素國家標(biāo)準(zhǔn)品對比，其移動位置應(yīng)相應(yīng)，生物法利用生物體進(jìn)行試驗(yàn)來鑒別藥物。例如，用家兔驚厥試驗(yàn)來鑒別胰島素，是通過胰島素的降血糖作用進(jìn)行鑒別的，當(dāng)劑量過大，血糖降低至肯定水平〔約30%〕，家兔即發(fā)生驚厥，迅速靜注50%葡萄糖注射液，補(bǔ)充血糖，驚厥停止，說明驚厥是胰島素所致低血糖而引起的。又如，依據(jù)肝素鈣具有延長血凝時(shí)間的特性進(jìn)行鑒別。應(yīng)該指出，由于生化藥物的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，仍有一局部生化藥物目前還未找到有效的鑒別方法。例如糜蛋白酶、糜胰蛋白酶、胰蛋白酶等。三、 雜質(zhì)檢查生化藥物分子較大，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有時(shí)成分并非單一，純化工藝較難，因此，生化藥物的雜質(zhì)檢查就顯得非常重要。一般雜質(zhì)檢查生化藥物的一般雜質(zhì)檢查工程包含氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽、銨鹽、鐵鹽、重金屬、酸度、溶液的澄清度或溶液的顏色、水分及枯燥失重、熾灼殘?jiān)?。其檢查的原理及方法與化學(xué)藥物中的一般雜質(zhì)檢查相同，不再贅述。特別雜質(zhì)檢查特別雜質(zhì)主要是指從生產(chǎn)工藝中引入或原料中帶入的雜質(zhì)。許多生化藥物是從生物組織中提取或用微生物發(fā)酵法制得，藥物中易殘存一些雜質(zhì)或其他成分。例如，胰蛋白酶是從動物膜中提取制得的一種蛋白水解酶，在制備過程中.易帶入雜質(zhì)糜蛋白酶，中國藥典〔1995年版〕和USP〔23〕均規(guī)定要檢查此酶，依據(jù)胰蛋白酶的特性選用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯為底物作糜蛋白酶的限度檢查。糜蛋白酶的限度為2500個(gè)胰蛋白酶單位中不得大于50單位，按每1mg胰蛋白酶為2500個(gè)單位和每1mg糜蛋白酶為1000單位，折算成重量，則糜蛋白酶的限度為5%〔g/g〕。四、 含量測定生化藥物的含量測定方法主要有理化法、生化法和生物檢定法。理化法適用于化學(xué)結(jié)構(gòu)明確的小分子生化藥物或經(jīng)水解變?yōu)樾》肿铀幬锏臏y定，含量常常用百分含量表示；生化法和生物檢定法多用于分子量較大的酶類和蛋白質(zhì)類藥物的含量測定，多用生物效價(jià)或酶活力單位表示測定結(jié)果?！惨弧忱砘ɡ砘ò瘜W(xué)分析法、分光光度法和色譜法以及其他方法，如門冬酰胺采納凱氏定氮法測定含量，甲狀腺粉采納氧瓶燃燒法測定含量。滴定分析法利用氨基酸類藥物分子的氨基的堿性，可采納非水溶液滴定法測定含量，如L—門冬氨酸、L—丙氨酸、色氨酸、蘇氨酸、組氨酸。谷氨酸利用羧基的酸性采納中和滴定法測定含量。甘露醇和山梨醇均采納碘量法測定，甘露醇與高碘酸發(fā)生定量氧化復(fù)原反響，剩余的高碘酸及生成的碘酸再與碘化鉀作用，生成游離碘，用硫代硫酸鈉液滴定。CHOH(CHOH)CHOH+5HIOT2HCHO+4HCOOH+5HIO+HO2 4 2 4 3 22HIO+14KI+7HSOT8I+7KSO+8HO4 2 4 2 2 4 2分光光度法生化藥物一般采納比色法和UV法測定含量。如硫酸軟骨素為大分子酸性粘多糖類藥物，其結(jié)構(gòu)中的雙糖單位分子中含一分子氨基己糖，采納Elson-Morgan比色法測定含量。先酸水解供試品，生成氨基己糖，然后在堿性條件下與乙酰丙酮反響，生成色原物質(zhì)，與對二甲氨基苯甲醛鹽酸醇溶液反響產(chǎn)生紅色，以鹽酸氨基葡萄糖為對比品，于525nm波長處測定吸光度。肌苷、胞磷膽堿鈉、細(xì)胞色素C等藥物采納UV法直接測定，以*?值計(jì)算含量，測定細(xì)胞色素C時(shí)應(yīng)注意，復(fù)原型細(xì)胞色素C在550nm波長處有最大汲取，峰形異常鋒利，在測定時(shí)要求儀器的狹縫應(yīng)小于1nm，以減少雜散光影響，并應(yīng)在550nm波長附近，每間隔0.5nm找出最大汲取波長，否則會給測定帶來較大的誤差，吧(瑚E為23.0。HPLC法HPLC法適用于高沸點(diǎn)、大分子量、熱穩(wěn)定性差的生物活性物質(zhì)的分析，常以具有肯定pH值的緩沖溶液作為流動相，常溫操作，分析環(huán)境與生理環(huán)境相似，因而具有和氣的分析條件與良好的生物兼容性，有利于保持生物大分子的構(gòu)象和生理活性等特點(diǎn)°HPLC法可以用于氨基酸及其衍生物、多肽、蛋白質(zhì)、糖類、葉啉、核酸及其降解產(chǎn)物的別離與測定。（1）反相高效液相色譜法〔RP-HPLC〕可以對氨基酸、肽、蛋白質(zhì)、多糖進(jìn)行分析。固定相盡量選擇球形全多孔硅膠鍵合相，分子量較小的藥物選用C18烷基硅膠鍵合相，分子量較大的藥物選用c8烷基硅膠鍵合相。流動相選用乙腈一水〔或緩沖溶液〕、甲醇一水〔或緩沖溶液〕。如復(fù)方氨基酸注射液、輔酶Qio等一般按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算各種氨基酸的含量。例11.三磷酸腺苷二鈉的含量測定三磷酸腺苷二鈉〔adenosinedisodiumtriphosphate〕的含量是通過測定總核苷酸和三磷酸腺苷二鈉的重量比來操縱的。三磷酸腺苷〔adenosinetriphosphate,ATP〕不穩(wěn)定性，易降解為二磷酸腺苷〔adenosinediphosphate,ADP〕至一磷酸腺苷〔adenosinemonophosphate,AMP〕，在生產(chǎn)、貯存與銷售期過程中，即使總核苷酸的量不變，ATP的重量比會隨時(shí)間的延長而逐漸下降，ChPATP-2Na含量是通過測定總核苷酸的量和ATP-2Na的重量比來操縱的。總核苷酸的量采納紫外分光法度法測定，ATP-2Na的重量比采納HPLC法測定。總核苷酸測定 取供試品加0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）使溶化并制成濃度為20Hg/ml的溶液，在259nm波長處測定吸光度，按C10H14N5Na2013P3汲取系數(shù)（*?）為279計(jì)算總核苷酸的量。ATP-2Na重量比測定色譜柱為Hypersil0DS（4mmX125mm,5|im），流動相為0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（取磷酸氫二鈉35.8g，磷酸二氫鉀13.6g，加水900ml溶化，用1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至7.0,參加四丁基溴化銨1.61g，加水至1000ml,搖勻）-甲醇（95：5）;檢測波長為259nm;柱溫為35°C;理論板數(shù)按ATP峰計(jì)算不低于3000;出峰次序依次為AMP-Na,ADP-2Na與ATP-2Na，各色譜峰的別離度應(yīng)符合要求。取供試品溶液〔4mg/ml〕10|1L，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算ATP-2Na在總核苷酸中的重量比：式中T1、T2、T3和Tx分別為AMP-Na、ADP-2Na、ATP-2Na和其他物質(zhì)的峰面積；0.671為AMP-Na與ATP-2Na分子量的比值；0.855為ADP-2Na與ATP-2Na分子量的比值。ATP-2Na含量為：ATP-2Na含量〔％〕=總核苷酸XATP-2Na重量比。〔2〕離子交換色譜（ion-exchangechromatography,IEC）該法適用于離子化合物和能夠解離的化合物，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)和核酸類藥物的分析。常用的固定相為以交聯(lián)共聚的苯乙烯一二乙烯苯或親水性高聚物凝膠為基質(zhì)的離子交換樹脂，流動相多為水溶液，有時(shí)可參加少量的有機(jī)溶劑，如乙醇、四氫呋喃、乙腈等，以增加某些組分的溶化度，改變別離的選擇性。IEC具有以下特點(diǎn)：1） 依據(jù)相應(yīng)的離子化程度對蛋白質(zhì)、多肽進(jìn)行別離。暴露在外的帶電荷的氨基酸殘端的數(shù)量（如天冬氨酸、賴氨酸）將影響洗脫過程。2） 梯度洗脫法是以鹽濃度增大而進(jìn)行的別離過程。樣品液必須和進(jìn)樣前的流動相保持相同的pH和離子強(qiáng)度。為獲得良好的重現(xiàn)性，進(jìn)樣前色譜柱必須充分平衡。典型的別離梯度是緩沖液為0.3mol/L?1.0mol/L的鹽溶液。柱效中等并具有較高質(zhì)量的活性回收。雖然獲得的峰比反相色譜峰更寬，但活性回收更佳?；钚缘鞍踪|(zhì)的回收可通過不同強(qiáng)弱交換類型的選擇而優(yōu)化。對于一些敏感蛋白質(zhì)，如果回收有問題，弱型離子交換劑可獲得更好的活性和質(zhì)量回收?！?〕分子排阻色譜法分子排阻色譜法〔size-exclusionchromatography,SEC〕也稱凝膠滲透色譜法(GelPermeationChromatography,GPC)，利用凝膠的分子篩作用，依據(jù)被測組分的分子尺寸而進(jìn)行別離，可以測定蛋白質(zhì)多肽類藥物的分子量，也可以測定如多糖、多聚核苷酸和膠原蛋白等生物大分子聚合物的分子量和分子量分布。柱填料主要為親水硅膠、葡聚糖凝膠〔Sephadex〕和聚丙烯酰胺凝膠(Sepharose)、微孔聚合物、微孔硅膠等。流動相應(yīng)對組分具有良好的溶化度，以及較低的粘度。在蛋白質(zhì)和多肽的分析中，通常選用交聯(lián)丙烯酸甲酯凝膠或二醇鍵合硅膠，依據(jù)樣品的分子量范圍，選擇色譜柱的級分范圍，流動相的選擇應(yīng)與蛋白質(zhì)樣品匹配，一般用0.1mol/L?0.2mol/L的緩沖溶液，pH為6?8。由于不同排阻范圍的葡聚糖凝膠有一特定的蛋白質(zhì)分子量范圍，在此范圍內(nèi)，分子量的對數(shù)和洗脫體積之間成線性關(guān)系。因此，用幾種已知分子量的蛋白質(zhì)為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行凝膠層析，以每種蛋白質(zhì)的洗脫體積對它們的分子量的對數(shù)作圖，繪制出標(biāo)準(zhǔn)洗脫曲線。未知蛋白質(zhì)在同樣的條件下進(jìn)行凝膠層析，依據(jù)其所用的洗脫體積，從標(biāo)準(zhǔn)洗脫曲線上可求出此未知蛋白質(zhì)對應(yīng)的分子量。例12.莫X分子量的測定莫X是由肝素經(jīng)化學(xué)修飾獲得的改構(gòu)肝素，采納GPC測定其分子量，色譜柱為為多糖專用凝膠柱，0.2mol/L硫酸鈉(稀硫酸調(diào)至pH5.0)為流動相；柱溫35°C；流速0.5ml/min；示差折光檢測器。由于肝素分子量為3000?40000，莫X作為改構(gòu)肝素其分子量也在此范圍，應(yīng)選用上述分子量范圍的標(biāo)準(zhǔn)品。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制中以已知分子量的葡聚糖〔Dextran〕為標(biāo)樣，分別取5個(gè)不同分子量的標(biāo)樣，加流動相制成10mg/ml的溶液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取25|!L進(jìn)樣，記錄色譜圖得保存時(shí)間tR，計(jì)算其回歸方程為：logMw=8.880-0.323tRr=0.996n=5周密稱取莫乂原粉適量，加流動相溶化，制成約10mg/ml的溶液，濾過，放置過夜。取25口L進(jìn)樣，記錄色譜圖。由回歸方程求出莫X的平均Mw為22788±469?！捕趁阜治龇ㄔ谏锼幬锏姆治鲋校阜治龇ㄖ饕富盍y定法和酶法分析兩種類型。酶活力測定法是一種以酶為分析對象，對生物藥物生產(chǎn)過程中所用的酶或酶類藥物的含量或酶活力進(jìn)行測定的方法；酶法分析則是一種以酶為分析工具或分析試劑的分析，主要用酶作試劑測定樣品中酶以外的其它物質(zhì)的含量。二者檢測的對象雖有所不同，但原理和方法都是以酶能專一而高效地催化某化學(xué)反響為根底，通過對酶反響速度的測定或?qū)ι晌锏葷舛鹊臏y定而檢測相應(yīng)物質(zhì)的含量。1.酶活力測定法 酶的活性是對酶的催化能力大小的度量。酶的單位〔國際單位IU〕是指在25°C下，以最適的底物濃度、最適的緩沖液離子強(qiáng)度以及最適的pH值諸條件下，每分鐘能轉(zhuǎn)化一個(gè)微摩爾底物的酶量定為一個(gè)活性單位。與酶活性有關(guān)的另一概念 比活性也很重要，比活性定為每一毫克蛋白質(zhì)所含的酶單位數(shù)〔單位數(shù)/毫克蛋白〕?！?〕根本原理酶是一種具有特別催化能力的蛋白質(zhì)類生物催化劑。酶活力是指酶催化肯定化學(xué)反響的能力，是對酶的催化能力大小的度量。酶活力的測定就是測定酶催化某一化學(xué)反響的速度，酶反響的速度愈快所表示的酶活力愈高。對于一個(gè)酶催化反響：式中：E為酶；S為酶底物；［ES］為反響的中間絡(luò)合物；P為產(chǎn)物。反響的初速度為酶底物濃度的函數(shù):

式中：V0為反響的初速度，Vmax為最大反響速度，［S］0底物的初始濃度°Vmax與常數(shù)K3和酶的濃度［E］有關(guān)：Vmax=K3［E］，則：在底物濃度肯定條件下，反響的初速度與酶的濃度成正比。在線性范圍內(nèi)測得酶催化反響初速度即可求出酶的濃度，如圖1-10-1所示。酶反響的速度可以用單位時(shí)間反響底物的減少或產(chǎn)物的增加來表示，測定產(chǎn)物或底物的變化量對時(shí)間作圖得“酶反響進(jìn)程曲線〃，曲線斜率表示反響速度。大多數(shù)酶的反響進(jìn)程曲線說明，在酶反響的最初階段里，底物或產(chǎn)物的變化量圖1-1圖1-1卜1底應(yīng)速度一酶濃度曲線Fig.1-10-1reactivespeed-eaz^tnaticconcentrationofcunes來；同時(shí)酸、堿、熱等也在漸漸地使酶失效。因此，這種情況下測得的反響速度已是一種表觀的、多種因素影響下的綜合結(jié)果，不能代表酶的真正活性。真正能代表酶催化活性的是反響初始階段的速度，即反響初速度。〔2〕酶反響的條件選擇反響條件的根本要求是：全部待測定的酶分子都應(yīng)該能夠正常地發(fā)揮它的作用。這就是說，反響系統(tǒng)中除了待測定的酶濃度是影響速度的惟一因素外，其它因素都處于最適于酶發(fā)揮催化作用的水平。確定反響條件時(shí)應(yīng)考慮以下因素：底物：為了便于測定，選用的底物〔包含人工合成底物〕最好在物理化學(xué)性質(zhì)上和產(chǎn)物不同，以便于測定。為了不使酶反響速度受限，反響系統(tǒng)應(yīng)該使用足夠高的底物濃度，判別標(biāo)準(zhǔn)是底物濃度［S］與Km的關(guān)系。依據(jù)Michaelis-Menten方程： ,匱I，如果要求反響速度到達(dá)最大速度的99%，則其底物的濃度應(yīng)為:100%[S]求反響速度到達(dá)最大速度的99%，則其底物的濃度應(yīng)為:100%[S]K.+IS][S]=99Km。大多數(shù)酶具有相對的專一性，在可被它作用的各種底物中一般選擇Km小的作測定的底物。

12茵長小m向于丙酮酸形成。因此在進(jìn)行酶要注意選擇適宜的反響pH,并將pH：氫離子濃度能對酶反響產(chǎn)生多種影響：它可能改變酶的活性中心的解離狀況，升高或降低酶的活性；也可能破壞酶的結(jié)構(gòu)與構(gòu)象導(dǎo)致酶失效；還可能作用反響系統(tǒng)的其它組成成分影響酶反響，甚至改變可逆反響進(jìn)行的方向。例如，乳酸脫氫酶反響在pH7時(shí)傾向乳酸?1-1D-2X4D12茵長小m向于丙酮酸形成。因此在進(jìn)行酶要注意選擇適宜的反響pH,并將Fig.1-1D-2W叩如rsofNADandpH10時(shí)則傾［舊 活力測定時(shí)反響維持在這一pH值。酶反響通常借助緩沖系統(tǒng)來操縱pH，因而有一個(gè)適宜的緩沖離子和離子強(qiáng)度問題。選擇緩沖離子應(yīng)考慮以下幾個(gè)問題：①選擇的離子的pK值須接近要調(diào)整的pH，因?yàn)樵谶@種情況下，緩沖能力最強(qiáng)。②緩沖離子不同，即使是同一酶反響所表現(xiàn)出來的活性水平可能各不相同，甚至最適pH也可能發(fā)生變化。③緩沖離子可能與酶活性的必需成分形成絡(luò)合物而導(dǎo)致酶活性的抑制。例如，磷酸能與多價(jià)陽離子如Ca2+等結(jié)合，硼酸能與多種有機(jī)化合物結(jié)合，從而抑制相應(yīng)的酶活性。④緩沖體系常因稀釋和溫度等變化改變其pH值。溫度：酶反響對溫度十分敏感，因?yàn)闇囟饶苤苯佑绊懟瘜W(xué)反響速度本身，也能影響酶的穩(wěn)定性，還可能影響酶的構(gòu)象和酶的催化機(jī)制。一般而言，溫度變化1°C，酶反響速度可能相差5%左右。因此，實(shí)驗(yàn)中溫度變動應(yīng)操縱在土0.1C以內(nèi)。酶反響的溫度通常選用25C、30C或37C。輔助因子：有些酶需要金屬離子，有些酶則需要相應(yīng)的輔酶物質(zhì)。為了提高酶在反響系統(tǒng)中的穩(wěn)定性，有些也需要某些相應(yīng)的物質(zhì)。例如，對疏基酶可參加二疏基乙醇、二疏基蘇糖醇〔DTT〕等?？瞻缀蛯Ρ龋好總€(gè)酶反響通常都應(yīng)該有適當(dāng)?shù)目瞻缀蛯Ρ取？瞻资侵鸽s質(zhì)反響和自發(fā)反響引起的變化量，它提供的是未知因素的影響?？瞻字悼赏ㄟ^不加酶，或不加底物，或二者都加〔但酶需預(yù)先經(jīng)過失效處理〕。對比是指用純酶或標(biāo)準(zhǔn)酶制劑測得的結(jié)果，主要作為比擬或標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)?！?〕酶活力的測定方法酶活力測定按取樣及檢測的方法可分為取樣測定法或連續(xù)測定法。1〕取樣測定法：在酶反響開始后不同的時(shí)間，從反響系統(tǒng)中取出肯定量的反響液，并用適當(dāng)?shù)姆椒ㄍＶ蛊浞错懞?，再依?jù)產(chǎn)物和底物在化學(xué)性質(zhì)上的差異，選用適當(dāng)?shù)臋z測方法進(jìn)行定量分析，求得單位時(shí)間內(nèi)酶反響變化量的方法。停止酶反響通常采納添加酶的變性劑或加熱使酶失效。常用的變性劑有：5%的三氯醋酸、3%的高氯酸或其它酸、堿、醇類。三氯醋酸是一種高效專一的蛋白質(zhì)變性劑和沉淀劑，其缺點(diǎn)是在紫外光區(qū)有汲取，而高氯酸沒有此缺點(diǎn)，并且用氫氧化鈉中和、冷卻后，KClO4還可沉淀除去，但它不適于對酸和氧化劑敏感的測定對象。用于停止反響的試劑應(yīng)依據(jù)具體反響靈敏掌握，例如，以對硝基酚的衍生物作底物的酶反響可用氫氧化鈉或氫氧化鉀停止反響，因?yàn)閴A有利于硝基酚發(fā)色。2〕連續(xù)測定法是基于底物和產(chǎn)物在物理化學(xué)性質(zhì)上的不同，在反響過程中對反響系統(tǒng)進(jìn)行直接連續(xù)檢測的方法。顯然從精確性和測定效率看連續(xù)法都比擬好?！?〕檢測方法在酶反響過程中底物減少或產(chǎn)物增加的測定，通常需要依據(jù)底物與產(chǎn)物性質(zhì)上的差異來選用的適當(dāng)檢測方法。常用的檢測方法有UV-VIS法、熒光分析法、電化學(xué)方法、化學(xué)反響法、同位素測定法等。UV-VIS法：在酶反響過程中，利用產(chǎn)物和底物在可見或紫外光區(qū)的汲取光譜特征的差異，選擇適宜的波長，測定反響過程中的變化情況。該法應(yīng)用最為廣泛，對一些原來反響中不發(fā)生光汲取變化的酶，可以通過與第二個(gè)酶的偶聯(lián)，使第一個(gè)酶的反響產(chǎn)物變成第二個(gè)酶的具有吸光度變化的底物進(jìn)行測定。例如脫氫酶的輔酶NADH與NADPH在338nm與340nm間有最大汲取，而其氧化型則無，在任何脫氫酶反響中，無論是NAD或NADP的復(fù)原，還是NADH或NADPH的氧化，都可以在340nm或其附近的測定吸光度的增減而測定之(圖1-10-2)。例13.糜蛋白酶的效價(jià)測定原理在肯定條件下，糜蛋白酶水解底物N-乙?；籐—酪氨酸乙酯(ATEE)，使吸光度值變小，通過測定吸光度的變化來測定水解反響的速率。以吸光度變化率計(jì)算活力單位，以ATEE單位表示效價(jià)。測定法取0.0012mol/L鹽酸溶液0.2ml與底物溶液3.0ml,在25°C±0.5°C，于237nm波長處測定并調(diào)節(jié)吸光度為0.200。再取供試品溶液0.2ml與底物溶液3.0ml，馬上記時(shí)并搖勻，每隔30s讀取吸光度，共5min，吸光度的變化率應(yīng)恒定，恒定時(shí)間不得少于3min假設(shè)變化率不能恒定，可用較低濃度另行測定。每30s的吸光度變化率應(yīng)操縱在0.008?0.012，以吸光度為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)，作圖，取在3min內(nèi)成直線的局部，按下式計(jì)算：式中P為每1ml糜蛋白酶的效價(jià)，單位；A2為直線上開始的吸光度；A1為直線上終止的吸光度；T為A2至A1讀數(shù)的時(shí)間，分；W為測定液中含供試品的量，mg;0.0075為在上述條件下，吸光度每分鐘改變0.0075，即相當(dāng)于1個(gè)糜蛋白酶單位。2〕熒光分析法：如果酶反響的底物與產(chǎn)物之一具有熒光，那么熒光變化的速度可代表酶反響速度。應(yīng)用此法測定的酶反響有兩類：一是脫氫酶等反響，它們的底物本身在酶反響過程中有熒光變化，例如NAD〔P〕H的中性溶液發(fā)強(qiáng)的藍(lán)白色熒光〔460nm〕，而NAD〔P〕+則無。另一類是利用熒光源底物的酶反響，例如可用熒光素二丁酯測定脂肪酶，熒光素二丁酯不發(fā)熒光，但水解后釋放熒光素。熒光素二丁酯 ?熒光素測定熒光強(qiáng)度的變化即為熒光素產(chǎn)生的速度。熒光分析法測得的酶活性水平通常以單位時(shí)間內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化〔AF/AtJ表示。熒光測定法的主要缺點(diǎn)是，熒光讀數(shù)與濃度間沒有確切的比例關(guān)系，而且常因測定條件如溫度、散射、儀器等而不同，所以如果要將酶活性以確定的單位表示時(shí)，首先要制備校正曲線，依據(jù)這曲線再進(jìn)行定量。熒光分析法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度極高，它比光汲取測定法還要高2?3個(gè)數(shù)量級，因此特別適于酶量或底物量極低時(shí)的快速分析。3〕旋光度法：利用反響物或產(chǎn)物在反響前后的旋光度變化進(jìn)行測定，在沒有其它更好的方法可用時(shí)，可考慮用旋光度測定法。4〕電化學(xué)方法：可以測定pH的變化；也可以恒定pH，不斷參加酸或堿使pH保持恒定，依據(jù)所參加的酸或堿的量來度量；或者采納離子選擇電極，如用銨離子選擇電極可測定尿素被酶水解中產(chǎn)生的銨離子，用氧電極可測定催化反響中消耗的氧。例14.抑肽酶的測定在pH8.0,25C的條件下，胰蛋白酶使N-苯甲?；籐—精氨酸乙酯(BAEE)水解為N-苯甲酰基一L—精氨酸，溶液pH值下降，加氫氧化鈉后，使溶液的pH值回復(fù)到8.0，水解反響繼續(xù)進(jìn)行。在胰蛋白酶溶液中參加抑肽酶，使50%胰蛋白酶的活性被抑制，剩余的胰蛋白酶與BAEE進(jìn)行水解反響，用氫氧化鈉滴定釋放出的酸，使溶液的pH值始終維持在7.9?8.1。在肯定時(shí)間，依據(jù)供試品消耗氫氧化鈉的量，計(jì)算酶活力單位。式中4000為系數(shù)；W為抑肽酶制成每1ml中約含1.67單位時(shí)的酶量，mg；n1為對比測定時(shí)每秒鐘消耗的氫氧化鈉滴定液〔0.1mol/L〕的容積，ml；n2為供試品溶液每秒鐘消耗的氫氧化鈉滴定液〔0.1mol/L〕的容積，ml;2為供試品溶液中所加胰蛋白酶的量為對比測定時(shí)的2倍；f為氫氧化鈉滴定液〔0.1mol/L〕的校正因子。2.酶分析法酶分析法是一種以酶為分析工具〔或試劑〕的分析方法。分析的對象可以是酶的底物、輔酶活化劑甚至酶的抑制劑。在進(jìn)行這類分析時(shí)，先要依據(jù)分析對象選擇適宜的“工具酶〃，然后再通過酶反響的測定，并借助相應(yīng)的校正曲線來測定它們的濃度或含量。在上述幾種檢測對象中，除了底物可以采納總變量分析法外，其他都只能用動力學(xué)分析法?！?〕動力學(xué)分析法通過條件操縱，分別使底物、輔酶活化劑或抑制劑的濃度在酶反響中起決定反響速度的主導(dǎo)作用，這時(shí)酶反響速度和上述相應(yīng)因素的濃度間將具有確定的比例關(guān)系，這樣測定酶反響的速度就可求出它們的濃度。酶分析法采納的條件和酶活力測定法的條件根本相同，但其所用的酶量必須肯定.被測物以外的其他反響成分均須保證處于恒定和最適。以下分別簡述各種物質(zhì)測定應(yīng)注意的問題。1〕被測物是酶的底物：當(dāng)?shù)孜餄舛萚