早期宮頸癌耐藥基因與臨床預(yù)后關(guān)系回顧性研究

早期宮頸癌耐藥基因與臨床預(yù)后關(guān)系回顧性研究【摘要】目的:探討耐藥基因p糖蛋白、谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ、胸苷酸合成酶在宮頸癌中的表達(dá)及臨床意義。方法:應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測65例宮頸癌中pgp、TOpoⅡ、GSTπ、TS的表達(dá)，并分析其與臨床預(yù)后之間的關(guān)系。結(jié)果:pgp的表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與UICC分期、局部復(fù)發(fā)無關(guān)；TOpoⅡ的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部復(fù)發(fā)有關(guān)，與腫瘤分化程度、UICC分期無關(guān)；GSTπ的表達(dá)與各個指標(biāo)之間均存在相關(guān)；TS與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、UICC分期有關(guān)，與局部復(fù)發(fā)、腫瘤分化無關(guān)。經(jīng)多因素cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析顯示：局部復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TOPOⅡ、GSTπ的表達(dá)與宮頸癌患者術(shù)后生存率有關(guān)。結(jié)論:宮頸癌中pgp、TOpoⅡ、GSTπ、TS的聯(lián)合檢測對判斷宮頸癌的預(yù)后十分必要；局部復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TOpoⅡ、GSTπ的表達(dá)可作為宮頸癌患者獨(dú)立的預(yù)后因素。

【關(guān)鍵詞】宮頸癌；多藥耐藥；免疫組織化學(xué)；預(yù)后

【ABSTRACT】Objective:Toinvestigatetheexpressionofpglycoprotein(pgp)、glutathionestransferaseπ(GSTπ)、topoisomeraseⅡ(TOpoⅡ)andthymidylatesynthase(TS)andtheirclinicalsignificanceinCervical:Theexpressionsofpgp、TOpoⅡ、GSTπ、TSproteinsweredetectedbyimmmunohistochemistrymethodinsixtyfivepatientswithCervicalCarcinomawhowerefollowedupmorethantenrelationshipbetweentheexpressionofantidrugproteinsandclinicalprognosiswere:Theexpressionofpgpwasassociatedwithlymphnodemetastasisandhistologicalgrading(P005)，butnotrelatedwithpartialrecurrenceandUICCstaging(P005);TheexpressionofTOpoⅡwasassociatedwithlymphnodemetastasisandpartialrecurrence(P005)，andnotassociatedwithhistologicalgradingandUICCstaging(P005);TheexpressionofGSTπwasassociatedwithallparameters(P005);TheexpressionofTSwasassociatedwithlymphnodemetastasisandUICCgrading(P005)，buthadnorelationshipwithpartialrecurrenceandhistologicalstaging(P005);AftermultivariateCoxanalysis,survivalratewascorrelatedwithpartialrecurrence,lymphnodemetastasisandexpressionsofTOPOⅡandGSTπ(P005)andfortheoperatedpatierts.Conclution:Thedetectionofthedrugresistancegenes:TOpoⅡandGSTπhasimportantclinicalsignificencefortheselectionofchemotherapyregimen；partialrecurrence,lymphnodemetastasisandtheexpressionofGSTπandTOpoⅡcanberegardedasindependentprognosticfactorsincervicalcarcinoma.

【KEYWORDS】Cervicalcarcinoma;Multidrugresistance;Immunohistochemistry;Prognosis

目前研究表明腫瘤耐藥機(jī)制主要有以下幾個方面：一是腫瘤細(xì)胞內(nèi)多藥耐藥基因及其表達(dá)產(chǎn)物p糖蛋白介導(dǎo)的多藥耐藥現(xiàn)象，稱為典型多藥耐藥；二是由拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ介導(dǎo)的，稱為非典型多藥耐藥；三是谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)；四是胸苷酸合成酶的表達(dá)[1~3]。宮頸癌是目前危害女性健康的常見腫瘤，發(fā)病年齡趨于年輕化，治療手段主要是手術(shù)治療。晚期宮頸癌主要以放射治療為首選，因此有關(guān)宮頸癌耐藥基因的研究報(bào)道較少。本研究利用免疫組織化學(xué)方法探討宮頸癌中pgp、GSTπ、TOpoⅡ、TS耐藥基因蛋白的表達(dá)與腫瘤的臨床病理特征、術(shù)后生存之間的關(guān)系，旨在為今后臨床宮頸癌患者預(yù)后的判斷提供可靠的理論依據(jù)。

2006年2月張凡等：早期宮頸癌耐藥基因與臨床預(yù)后關(guān)系回顧性研究第1期2006年2月河北北方學(xué)院學(xué)報(bào)第1期

1資料與方法

11一般資料

收集我院19851~199512月住院患者中臨床病理資料齊全，并有10年以上隨訪結(jié)果的宮頸癌患者65例，所有病例均為原發(fā)早期宮頸鱗狀細(xì)胞癌，都進(jìn)行了宮頸癌手術(shù)治療，未作術(shù)后化療、放療等輔助治療；年齡25~69歲，平均年齡51歲；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例；無局部復(fù)發(fā)42例，局部復(fù)發(fā)23例；按照M分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期：Ⅰ期25例，Ⅱ期40例。資深病理醫(yī)師對切片進(jìn)行復(fù)習(xí)確診，其中高分化8例，中分化39例，低分化18例。

12免疫組織化學(xué)染色

所有標(biāo)本經(jīng)10%甲醛常規(guī)固定,石蠟包埋,4μm連續(xù)切片。pgp、TOpoⅡ、GSTπ、TS一抗試劑均購自北京中山試劑公司；主要免疫組化步驟：二甲苯脫蠟、梯度酒精至水，3%雙氧水滅活內(nèi)源性過氧化酶，PBS緩沖液振洗，正常山羊血清封閉、一抗冰箱過夜，二抗、三抗各1h，DAB顯色10~15min，蘇木素復(fù)染脫水透明，中性樹膠封片。

結(jié)果判斷:著色細(xì)胞10%為陰性,10%為陽性。pgp陽性表達(dá)定位在腫瘤細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，TOpoⅡ陽性表達(dá)定位在細(xì)胞核，GSTπ陽性物質(zhì)定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，TS陽性物質(zhì)定位在細(xì)胞質(zhì)。采用HIPAS100圖象分析軟件對所有切片進(jìn)行圖象分析，每張切片隨機(jī)選取5個著色典型區(qū)域且不重復(fù)的視場，測量每個視場中陽性單位，取其均數(shù)即為該切片的著色強(qiáng)度，所有的結(jié)果都以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

13統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS100統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。不同組間表達(dá)率的比較采用Fisher精確概率法，各指標(biāo)表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間作直線回歸相關(guān)分析，對全部病例用cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行單因素和多因素生存分析，并對有預(yù)后價值的指標(biāo)作KaplanMeier生存曲線。以α=005作為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

65例宮頸癌病例中，pgp陽性40例，TOpoⅡ陽性28例、GSTπ陽性35例，TS陽性18例。GSTπ在高中分化癌中的陽性表達(dá)率明顯低于在低分化癌中的表達(dá)率，在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達(dá)率明顯低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，Ⅰ期的陽性表達(dá)率明顯低于Ⅱ期，無復(fù)發(fā)組的陽性表達(dá)率低于復(fù)發(fā)組的陽性表達(dá)率。TS在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性表達(dá)率明顯低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)率；TOpoⅡ在復(fù)發(fā)組中的表達(dá)率明顯低于在無復(fù)發(fā)組中的表達(dá)率。

各指標(biāo)的著色強(qiáng)度與腫瘤的各臨床病理參數(shù)之間做直線回歸相關(guān)分析顯示：pgp的表達(dá)與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與局部復(fù)發(fā)及UICC分期無關(guān)；TOpoⅡ的表達(dá)與局部復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與腫瘤分化程度、UICC分期無關(guān)；GSTπ的表達(dá)與各個指標(biāo)之間均存在相關(guān)；TS的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、UICC分期有關(guān)，與腫瘤分化程度、局部復(fù)發(fā)無關(guān)。

臨床病理特征、耐藥基因蛋白表達(dá)與術(shù)后生存之間的關(guān)系對隨訪資料進(jìn)行單因素Cox模型分析，結(jié)果顯示：宮頸癌分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、UICC分期及TOpoⅡ、GSTπ的表達(dá)均與術(shù)后生存之間明顯相關(guān)，TOpoⅡ與術(shù)后生存之間存在明顯負(fù)相關(guān)。多因素Cox模型分析結(jié)果顯示：只有局部復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TOpoⅡ和GSTπ的表達(dá)與術(shù)后生存時間之間存在明顯相關(guān)，即出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TOpoⅡ低水平表達(dá)和GSTπ表達(dá)水平越高，患者的術(shù)后生存時間越短，生存率越低。

3討論

腫瘤耐藥是其在適應(yīng)抗癌藥物的微環(huán)境生存中的重要的機(jī)制，分為原發(fā)耐藥和繼發(fā)耐藥，前者是腫瘤細(xì)胞的內(nèi)在性耐藥，發(fā)生于化療后的耐藥稱為獲得性耐藥。另外腫瘤細(xì)胞對一種藥物產(chǎn)生耐藥后可能對與這種藥物結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制完全不同的其它藥物產(chǎn)生耐表1pgp、TOpoⅡ、GSTπ、TS在各組中表達(dá)陽性率比較表2pgp、TOpoⅡ、GSTπ、TS表達(dá)與臨床病理參數(shù)相關(guān)分析表3臨床病理特征、耐藥基因蛋白表達(dá)與術(shù)后生存之間關(guān)系

臨床病理特征例數(shù)生存小于60個月例數(shù)生存60~120個月例數(shù)生存大于120個月例數(shù)組織類型高分化8332中分化3920127低分化181053淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無轉(zhuǎn)移215124有轉(zhuǎn)移4419187復(fù)發(fā)無復(fù)發(fā)4282410復(fù)發(fā)231283UICC分期Ⅰ期254156Ⅱ期4015187耐藥基因GSTπ陽性3515146GSTπ陰性309129TOpoⅡ陽性288911TOpoⅡ陰性37121510pgp陽性2510105pgp陰性40122010TS陽性181053TS陰性47151715表4宮頸癌術(shù)后生存單因素分析表5宮頸癌多因素生存分析結(jié)果藥，此即多藥耐藥，常常導(dǎo)致聯(lián)合化療方案的失敗。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的耐藥譜明確的耐藥基因共有11種，可分為藥泵蛋白、藥物代謝酶類、DNA修復(fù)酶、蛋白質(zhì)合成限速酶等。已有文獻(xiàn)顯示早期宮頸癌的預(yù)后良好，Ⅰ期患者術(shù)后五年生存率為100%，Ⅱ期術(shù)后五年生存率為85%，然而調(diào)查發(fā)現(xiàn)早期宮頸癌患者術(shù)后生存差別很大，對其進(jìn)行的耐藥基因的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果提示腫瘤細(xì)胞耐藥基因表達(dá)差別明顯。本次實(shí)驗(yàn)對耐藥基因和術(shù)后生存之間的關(guān)系進(jìn)行研究，旨在探討耐藥發(fā)生機(jī)制，并尋找對臨床預(yù)后具有意義的關(guān)鍵指標(biāo)。

目前公認(rèn)最主要的多藥耐藥基因是MDR1的過度表達(dá)。人類腫瘤的多藥耐藥基因家族由MDR1和MDR3組成，僅MDR1表達(dá)與腫瘤耐藥性有關(guān)[5，6]。MDR1是編碼分子量為170KD的細(xì)胞膜糖蛋白，命名為p糖蛋白，又稱p170，其功能為能量依賴性跨膜外排泵，使細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積減少，從而使細(xì)胞對藥物耐藥，同時對不同的親脂類藥物產(chǎn)生交叉耐藥。已有的研究表明MDR1在宮頸癌、腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌中通常高水平表達(dá)，而乳腺癌、卵巢癌中出現(xiàn)低水平表達(dá)。Weinstein等研究顯示pgp陽性表達(dá)的結(jié)腸癌易于浸潤血管和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。Winaler等對隨訪的112例宮頸癌患者進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)：pgp陽性患者術(shù)后5年生存率顯著低于pgp陰性患者。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：早期宮頸癌pgp陽性率615%，陽性區(qū)域呈現(xiàn)彌散分布特點(diǎn)。在各組間的陽性表達(dá)率之間無明顯差別。其表達(dá)水平較高，且表達(dá)水平與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈明顯正相關(guān)，與腫瘤局部復(fù)發(fā)、UICC分期無明顯相關(guān)性，并且經(jīng)單因素和多因素cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析該指標(biāo)對早期宮頸癌預(yù)后無意義。因此我們認(rèn)為pgp對宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否具有監(jiān)測意義，但不能作為早期宮頸癌預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。

GSTπ是一組多功能藥物代謝酶，與細(xì)胞內(nèi)解毒密切相關(guān)，臨床應(yīng)用的許多抗腫瘤藥物都可在GST的催化下通過谷胱甘肽結(jié)合而解毒。GST根據(jù)等電點(diǎn)的不同分為堿性、中性和酸性三種。其中酸性GST是腫瘤細(xì)胞和組織中最常見的同功酶，在許多耐藥細(xì)胞尤其是MDR陽性表型的細(xì)胞中高表達(dá)。GSTπ主要分布于消化道、泌尿系統(tǒng)和呼吸道上皮。在結(jié)腸上皮、腺瘤、結(jié)腸癌和患者血清中都可檢測到GSTπ，而且其表達(dá)水平與臨床分期呈正相關(guān)；Waster等研究顯示：GSTπ基因的啟動子可上調(diào)VEGF的表達(dá)[9,10]。我們的實(shí)驗(yàn)顯示：GSTπ陽性率為538%，陽性區(qū)域呈彌散分布，其表達(dá)水平與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部復(fù)發(fā)、UICC分期都呈正相關(guān)，且陽性患者的術(shù)后生存時間明顯短于陰性患者，因此推測該耐藥基因的高表達(dá)不僅預(yù)示腫瘤耐藥性的獲得，同時腫瘤誘導(dǎo)宿主血管長入瘤體，使腫瘤惡性程度增加，更具侵襲和轉(zhuǎn)移特性；單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析顯示，GSTπ表達(dá)可作為宮頸癌患者一項(xiàng)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)，因此早期宮頸癌GSTπ的陽性表達(dá)預(yù)示預(yù)后不良。

DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ是一種能將DNA由一種拓?fù)洚悩?gòu)體變?yōu)榱硪环N拓?fù)洚悩?gòu)體的酶，是真核細(xì)胞不可缺少的一種重要核酶，參與基因重組、轉(zhuǎn)錄和DNA修復(fù)等[11,12]。Dranks等首先發(fā)現(xiàn)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ與耐藥有關(guān)，TOpoⅡ介導(dǎo)的耐藥性的基礎(chǔ)即在于TOpoⅡ含量的減少和TOpoⅡ活性的降低[13]。Nakopoulou等報(bào)道，膀胱癌組織中TOpoⅡ的表達(dá)率為427%，且其表達(dá)水平降低與患者的不良預(yù)后有關(guān)[14]。我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)TOpoⅡ陽性率為281%，表達(dá)水平較低，陽性區(qū)域呈小片狀散在分布，表達(dá)水平與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈明顯相關(guān)，與腫瘤組織類型、UICC分期無明顯相關(guān)，但經(jīng)單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析顯示，TOpoⅡ表達(dá)可作為宮頸癌患者一項(xiàng)獨(dú)立的預(yù)后因素。

TS是合成胸苷酸的限速酶，可使dUMP甲基化形成dTMP，TS在宮頸癌細(xì)胞的DNA合成中起重要作用。5FU進(jìn)入人體后先轉(zhuǎn)變成FdUMP，再與TS和四氫葉酸共同形成三元絡(luò)合物，阻止dTMP合成，從而干擾DNA的合成，達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的[15,16]。TS的過表達(dá)使FdUMP不能完全抑制TS的作用，腫瘤細(xì)胞對5FU產(chǎn)生耐藥。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明宮頸癌中TS的表達(dá)與組織類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及UICC分期明顯相關(guān)，與腫瘤侵犯深度無關(guān)，單因素分析TS的表達(dá)與預(yù)后有關(guān)，但多因素分析顯示TS不能作為腫瘤預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。

多因素分析顯示：局部復(fù)發(fā)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可作為不良預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。提示復(fù)發(fā)腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移腫瘤惡性程度增加，更具浸潤和轉(zhuǎn)移特性。

所有病例中四種指標(biāo)都表達(dá)的共12例，各個指標(biāo)的表達(dá)水平之間作直線回歸相關(guān)分析，結(jié)果顯示：GSTπ與TOpoⅡ之間存在明顯負(fù)相關(guān)，其余均不存在相關(guān)。腫瘤細(xì)胞同時存在多種原發(fā)性耐藥機(jī)制，各種機(jī)制之間的相互作用可能便利了腫瘤耐藥，有關(guān)這方面的研究報(bào)道較少，尚需今后深入研究；我們實(shí)驗(yàn)樣本偏小，得出的結(jié)果可能存在一定的偏差，尚需今后大樣本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

總之，我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)宮頸癌中pgp、TOpoⅡ、GSTπ、TS的表達(dá)與腫瘤的臨床病理參數(shù)之間存在不同程度的相關(guān)，因此這些指標(biāo)的表達(dá)對宮頸癌化療藥物的選擇以及臨床預(yù)后的判斷都具有重要監(jiān)測意義；局部復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TOpoⅡ、GSTπ的表達(dá)可作為檢測宮頸癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。

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