第二章質(zhì)粒DNA的微量提取SDS法

實驗二質(zhì)粒DNA的微量提取堿裂解法（SDS法）一.目的與要求通過質(zhì)粒的一些基本特性、質(zhì)粒DNA的提取技術(shù)，學(xué)習(xí)用堿變性法提取質(zhì)粒DNA的方法。二.相關(guān)知識

質(zhì)粒(Plasmid)：獨立于染色體外的，能自主復(fù)制且穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。絕大多數(shù)是一種環(huán)狀的雙鏈DNA分子。廣泛存在于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動植物細(xì)胞中，在細(xì)菌細(xì)胞中最多。細(xì)菌質(zhì)粒是用的最多的質(zhì)粒類群，其大小從1Kb-200Kb，它們復(fù)制時利用宿主細(xì)胞復(fù)制自身基因組DNA的同一組酶系。質(zhì)粒DNA的存在區(qū)域和結(jié)構(gòu)特征電鏡中質(zhì)粒DNA的形態(tài)嚴(yán)謹(jǐn)型：質(zhì)粒的復(fù)制受到寄主細(xì)胞嚴(yán)格控制，與寄主細(xì)胞的復(fù)制偶聯(lián)同步。因此，在一個細(xì)胞中只有1個或幾個拷貝；松馳型：質(zhì)粒的復(fù)制是在寄主細(xì)胞的松弛控制之下的，每個細(xì)胞中含有10-200個拷貝。用一定的藥物處理，抑制寄主蛋白質(zhì)的合成才會使質(zhì)?？截悢?shù)增至幾千份。質(zhì)粒pBR322即屬于松弛型質(zhì)粒，要經(jīng)過氯霉素處理才能達(dá)到更高拷貝數(shù)。質(zhì)粒類型：載體(Vector)：

用于攜帶重組DNA，并且能夠使外源DNA一起復(fù)制或表達(dá)的質(zhì)粒(運載工具)。具備的條件:

1.具備條件（1）易于鑒定；（2）在受體細(xì)胞中

可以獨立復(fù)制；（3）易于篩選；（4）易于導(dǎo)入受體細(xì)胞。2.結(jié)構(gòu)特征(1)抗性基因（Ampicillingene,Kanamycinegene)(2)啟始復(fù)制子（ori)；(3)多克隆位點(MSC)；(4)標(biāo)記基因(LacZgene)。InsertEcoRIXhoI1.9kbDNA是具有一定結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，特殊的環(huán)境會導(dǎo)致DNA的變性，如加熱、極端pH值、有機(jī)溶劑、尿素、酰胺試劑等，而適宜的環(huán)境又可以使DNA復(fù)性。三.原理：SDS是一種陰離子表面活性劑，既能使細(xì)菌細(xì)胞裂解，又能使一些蛋白質(zhì)變性，所以SDS處理細(xì)菌細(xì)胞后，會導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁的破裂，從而使質(zhì)粒DNA以及基因組DNA從細(xì)胞中同時釋放出來。釋放出來的DNA遇到強(qiáng)堿性（NaOH）環(huán)境，就會變性。然后，用酸性乙酸鉀中和溶液，使溶液處于中性，質(zhì)粒DNA將迅速復(fù)性，而基因組DNA，由于分子巨大，難以復(fù)性。離心后，質(zhì)粒DNA將在上清中，而基因組DNA則與細(xì)胞碎片一起沉淀到離心管的底部。四.細(xì)菌裂解的方法：(1)堿裂解法：0.2molNaOH+1%SDS;(2)煮沸裂解法:沸水煮沸40s;(3)SDS裂解法：10%SDS,用于質(zhì)粒大量提取。五.DNA濃度的測定：(1)分光光度計法:堿基(G,A,T,C）在260nm處具有強(qiáng)吸收峰，一般在中性pH值左右的環(huán)境中進(jìn)行測定。這種方法常測定比較純的樣品。(2)熒光的強(qiáng)度法：(3)凝膠電泳比對法，與標(biāo)準(zhǔn)分子量相比較。六.材料和儀器1.材料:含有質(zhì)粒P3.5K-EGFP的大腸桿菌DH5α。P3.5K-EGFP是一種酵母熒光表達(dá)載體，常用于檢測酵母中外源基因表達(dá)強(qiáng)度和亞細(xì)胞定位。2.試劑：裂解液一，裂解液二，裂解液三，酚氯仿，異丙醇，70%乙醇，TE等。3.儀器設(shè)備：高速離心機(jī)，移液器，搖床等4.加入400l新配制的裂解液二，加蓋顛倒6-7次使之混勻，放置3-5min（不得超過5min）;七.質(zhì)粒微量提取的方法培養(yǎng)細(xì)菌收集菌體懸浮菌體裂解菌體1.將帶有質(zhì)粒的DH5a接種到3-5ml含有amp抗生素的液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12-16h;2.取液體培養(yǎng)液1.4ml于Ep管中，10000rpm離心1min，去掉上清液，重復(fù)步驟2；最后瞬時離心后，用移液器去除上清。（所有去除殘液均用此法）3.加入200l裂解液一，渦旋混勻放置5min;5.加入300L裂解液三(乙酸鉀溶液)，加蓋后顛倒6-7次混勻，放置3-5min;中和復(fù)性6.用臺式高速離心機(jī)，12000rpm離心10min。離心除雜12.將分離出的質(zhì)粒DNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?.沉淀用0.5mL70％乙醇清洗一次，12000rpm離心5min，棄上清，重復(fù)9；11.加入20-30l含有20g/mlRNase的ddH2O或TE溶解，室溫放置15-30min，使DNA充分溶解.去蛋白沉淀洗滌7.將700L上清移入另一干凈離心管，加入等體積的酚、氯仿（700ul），12000rpm離心10min。10.瞬時離心，用移液器將管底殘余液體移除，小管倒置于吸水紙上，室溫自然干燥至透明;樣品干燥樣品溶解樣品保存8.取600L上清到另一離心管中，加入等體積冰凍異丙醇，混勻，12000r/min離心5min，棄上清;離心收集(1)取2l提取的質(zhì)粒DNA，加入98L蒸餾水對待測DNA樣品做1:50(或更高倍數(shù)的稀釋);(2)蒸餾水作為空白,在波長260nm、280nm處調(diào)節(jié)紫外分光光度計讀數(shù)至零。(3)加入DNA稀釋液，測定260nm及280nm的吸收值，并記錄。(4)通過計算確定DNA濃度或純度，濃度單位為g/ml,dsDNA=50×(OD260)×稀釋倍數(shù)補(bǔ)充內(nèi)容—1.用分光光度計法定量DNA260nm讀數(shù)用于計算樣品中核酸的濃度，OD260值為1相當(dāng)于約50g/ml雙鏈DNA，33g/ml單鏈?？筛鶕?jù)在260nm以及在280nm的讀數(shù)的比值（OD260/OD280）估計核酸的純度。一般DNA的純品，其比值為1.8，低于此值說明有蛋白質(zhì)或其它雜質(zhì)的污染。補(bǔ)充內(nèi)容—2.凝膠電泳檢測DNA的濃度實驗步驟實驗步驟見下一個試驗—《瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)的原理和方法》結(jié)果1%的瓊脂糖凝膠，90V,40分鐘。NEB標(biāo)準(zhǔn)分子量片段(1kbDNALadder)1kbDNALadder雖然不能對DNA質(zhì)量進(jìn)行精確定量分析，但可以通過與相近的條帶進(jìn)行比較估算出大概的數(shù)據(jù)。片段堿基對質(zhì)量110,00242ng28,00142ng36,00150ng45,00142ng54,00133ng63,001125ng72,00048ng8