雙氫青蒿素對人喉癌細(xì)胞HeP

雙氫青蒿素對人喉癌細(xì)胞HeP【摘要】目的：雙氫青蒿素作用于人喉癌細(xì)胞，觀察藥物對其生長抑制作用.方法：采用細(xì)胞計數(shù)法、MTT法、軟瓊脂克隆形成試驗等觀察、測定雙氫青蒿素對喉癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖率、細(xì)胞群體倍增時間、雙氫青蒿素對HeP2細(xì)胞生長抑制作用的劑量－效應(yīng)曲線、時間－效應(yīng)曲線以及對該細(xì)胞克隆形成率的影響.結(jié)果：①細(xì)胞生長曲線顯示該細(xì)胞增殖活躍，生長穩(wěn)定，細(xì)胞群體倍增時間為247h；②雙氫青蒿素對Hep2細(xì)胞有明顯的生長抑制作用,其作用特點呈濃度依賴性，其IC50值為446684μg/L.時間－效應(yīng)曲線顯示：當(dāng)作用時間在24~120h時，呈劑量依賴性關(guān)系及時間依賴性關(guān)系.③雙氫青蒿素藥物濃度分別為320、1000、3200、10000μg/L時，克隆形成率分別為1150、09、06和05.結(jié)論：雙氫青蒿素對HeP2細(xì)胞增殖及其生長有顯著的抑制作用，隨著藥物作用時間的延長，對于細(xì)胞的生長抑制作用逐漸增強，表明雙氫青蒿素在喉癌的化學(xué)治療中對腫瘤細(xì)胞有直接的細(xì)胞毒作用.

【關(guān)鍵詞】腫瘤；細(xì)胞；青蒿素；喉腫瘤

0引言

腫瘤的形成是一個多因素、多階段、長期作用的過程，惡性腫瘤的形成是細(xì)胞生長與增殖的調(diào)控發(fā)生嚴(yán)重紊亂且復(fù)雜的過程.有資料表明，青蒿素及其衍生物對鼠艾氏腹水瘤細(xì)胞和人Hela細(xì)胞有細(xì)胞毒活性.用青蒿琥酯處理的HepG細(xì)胞可見梯狀DNA和凋亡小體［1］.本實驗將雙氫青蒿素作用于HeP2細(xì)胞，觀察對其生長抑制作用，旨在探討抗腫瘤侵襲及腫瘤治療方面為臨床用藥的篩選奠定一定實驗基礎(chǔ).

1材料和方法

11細(xì)胞來源HeP2細(xì)胞系由第四軍醫(yī)大學(xué)秦都口腔醫(yī)學(xué)院口腔生物學(xué)教研室提供.細(xì)胞培養(yǎng)于含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，體積分?jǐn)?shù)為50mL/LCO2，37℃，飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng).

12主要實驗儀器、試劑雙氫青蒿素純品由北京科泰新技術(shù)公司方輝藥業(yè)有限公司提供,生理鹽水稀釋；MTT為Sigma公司產(chǎn)品；RPMI1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶為Gibco產(chǎn)品.

13細(xì)胞增殖率測定取對數(shù)生長期HeP2細(xì)胞，常規(guī)消化后接種于24孔培養(yǎng)板，接種濃度為1×107個/L，計數(shù)法測定細(xì)胞增殖情況，實驗重復(fù)3次,取平均值作圖并計算細(xì)胞群體倍增時間.細(xì)胞群體倍增時間計算公式:DT(h)=t×lg2/(LgNt-lgNo)t代表細(xì)胞處于對數(shù)生長期的培養(yǎng)時間，No及Nt分別代表對數(shù)生長期的起始和終止的細(xì)胞數(shù).

14雙氫青蒿素對HeP2細(xì)胞生長抑制作用的劑量－效應(yīng)曲線取對數(shù)生長期細(xì)胞，常規(guī)消化后以1×106個/L濃度接種于96孔培養(yǎng)板，24h后細(xì)胞貼壁.加入濃度為100～32000μg/L的6個濃度的雙氫青蒿素，對照組加入不含藥物的等體積RPMI1640培養(yǎng)液，每組分別設(shè)5個平行孔.常規(guī)培養(yǎng)5d，MTT比色法測定每組A490nm值.實驗重復(fù)3次，取均值作圖.以藥物劑量的對數(shù)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)，繪制劑量－效應(yīng)曲線、時間效應(yīng)曲線計算IC50值.

15雙氫青蒿素對HeP2細(xì)胞生長抑制作用的時間－效應(yīng)曲線接種細(xì)胞與實驗加藥分組同14.分別于藥物作用1、2、3、4、5d后，MTT比色法測定每組A490nm值.實驗重復(fù)3次，取均值，繪制時間－效應(yīng)曲線并計算IC50值.

16軟瓊脂克隆形成試驗采用雙層瓊脂培養(yǎng)法在24孔板中進(jìn)行，底層含5mL/L瓊脂，每孔1mL，4℃凝固.對照組加入等體積RPMI1640培養(yǎng)液.每組分別設(shè)4個平行孔.實驗組雙氫青蒿素藥物濃度分別為320、1000、3200、10000、32000μg/L.常規(guī)培養(yǎng)2wk.倒置顯微鏡下計數(shù)每孔克隆數(shù)，計算克隆形成率，實驗重復(fù)3次.按公式計算克隆形成率×100％.

17數(shù)據(jù)處理與分析細(xì)胞生長存活率=實驗組光吸收值÷對照組光吸收值×100%.IC50定義為使實驗組光吸收值下降至對照組的50%時的藥物濃度，應(yīng)用MicrosoftEXCEL軟件繪制劑量－效應(yīng)曲線，作圖法計算雙氫青蒿素對Hep2細(xì)胞的IC50值.

2結(jié)果

21HeP2細(xì)胞生長曲線細(xì)胞生長曲線顯示該細(xì)胞增殖活躍，生長穩(wěn)定，細(xì)胞群體倍增時間為247h，表明該細(xì)胞適合在觀察生長變化的實驗中應(yīng)用.

22雙氫青蒿素對Hep2細(xì)胞生長抑制作用雙氫青蒿素作用于Hep2細(xì)胞,在小劑量情況下對細(xì)胞殺傷作用較輕,隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞生長明顯抑制，其作用特點表現(xiàn)為明顯的濃度依賴性，IC50值為446684μg/L.雙氫青蒿素對Hep2細(xì)胞藥物劑量－效應(yīng)曲線見Fig2.雙氫青蒿素作用于Hep2細(xì)胞的時間效應(yīng)關(guān)系如Fig3所示,藥物各濃度作用組在作用12h內(nèi)，對細(xì)胞生長無明顯抑制作用，當(dāng)作用時間在24~120h時，表現(xiàn)出劑量依賴性關(guān)系及時間依賴性關(guān)系.

23雙氫青蒿素作用Hep2細(xì)胞克隆形成率檢測雙氫青蒿素作用于Hep2細(xì)胞可顯著降低其克隆形成率.試驗可見實驗組細(xì)胞克隆形成逐漸減少，對照組及各濃度組克隆形成數(shù)及克隆形成率見Tab1.從克隆形態(tài)觀察，對照組克隆體積大且呈球狀，實驗組克隆體積小，形態(tài)不規(guī)則.表1雙氫青蒿素作用HeP2細(xì)胞克隆數(shù)及克隆率

3討論

腫瘤的生長和發(fā)展取決于腫瘤細(xì)胞的增殖與死亡比例,防治腫瘤是降低惡性腫瘤死亡率的重要途徑之一,有關(guān)腫瘤治療研究成為國際上關(guān)注的課題.目前從腫瘤的分子發(fā)生上講，腫瘤的發(fā)生與癌基因的激活、抑癌基因的抑制調(diào)節(jié)基因和DNA修復(fù)基因的異常等細(xì)胞增殖分化以及死亡平衡失調(diào)等多種因素有關(guān).惡性腫瘤形成的基本模式致瘤因素引起基因損傷，即獲得原癌基因和/或滅活腫瘤抑制基因，可能還累及凋亡基因和/或DNA修復(fù)基因，使細(xì)胞出現(xiàn)多克隆性增殖，在進(jìn)一步基因損傷基礎(chǔ)上，發(fā)展成為克隆性增殖，形成具有不同生物學(xué)特性的亞克隆，獲得浸潤和轉(zhuǎn)移的能力.

青蒿素是從菊科艾屬黃花蒿(artemisiaannua)莖葉中提取的一種含過氧基團的倍半萜內(nèi)酯.雙氫青蒿素是我國自行研制的抗瘧新藥，是青蒿素的一個重要衍生物，由青蒿素經(jīng)四氫硼鈉還原而成［2］.雙氫青蒿素具有吸收良好、分布廣、排泄和代謝迅速、高效、低毒等優(yōu)點,其口服生物利用度是青蒿素的10倍以上,抗瘧作用是青蒿素的4～8倍［3，4］.近年來，青蒿素類藥物的應(yīng)用日益廣泛，在抗腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用更為引人注目.對不同組織中培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn),雙氫青蒿素對白血病、黑色素瘤、結(jié)腸癌、前列腺癌和乳腺癌細(xì)胞株高度敏感,而對非小細(xì)胞肺癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、卵巢癌和腎癌細(xì)胞株的活性較低［5］.國內(nèi)外對青蒿素類藥物抗腫瘤研究相對集中于白血病、腹水瘤、乳腺癌、肝癌等，在喉癌細(xì)胞方面報道較少［6］.

喉癌是常見的惡性腫瘤，以磷狀細(xì)胞癌為多見，目前大多數(shù)治療方法為手術(shù)切除后行放療化療.本實驗將雙氫青蒿素作用于喉癌細(xì)胞，實驗結(jié)果表明該藥物對HeP2增殖及其生長有顯著的抑制作用，其作用呈明顯的劑量依賴性；同時，隨著藥物作用時間的延長，對于細(xì)胞的生長抑制作用逐漸增強，表明雙氫青蒿素在喉癌的化學(xué)治療中對腫瘤細(xì)胞有直接的細(xì)胞毒作用.研究表明，青蒿素化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有具有抗癌活性的α次甲基內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)的萜類化合物，青蒿素的抗腫瘤作用可能與其作用于轉(zhuǎn)鐵蛋白影響細(xì)胞鐵代謝從而抑制其DNA合成達(dá)到抑制細(xì)胞生長有關(guān)［7］，其具體的藥理作用與機制尚待進(jìn)一步研究.

【參考文獻(xiàn)】

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