新風(fēng)膠囊對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠行為及心肌超微結(jié)構(gòu)的影響

新風(fēng)膠囊對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠行為及心肌超微結(jié)構(gòu)的影響【摘要】觀察新風(fēng)膠囊對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠行為及心肌超微結(jié)構(gòu)的影響。方法：將55只大鼠隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組、模型組、甲氨喋呤組，雷公藤多苷片組和新風(fēng)膠囊組。每組各11只。除正常對(duì)照組外，向每只大鼠右后足跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑ml制成AA模型。觀察各組大鼠行為和心肌超微結(jié)構(gòu)的變化。結(jié)果：各治療組大鼠的足跖腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)均顯著降低。其中XFC組大鼠的自主活動(dòng)次數(shù)顯著增加，跳臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)明顯減少，跳下平臺(tái)的時(shí)間延長，反應(yīng)時(shí)間縮短；心肌肌原纖維整體結(jié)構(gòu)完整，大部分嵴突完整。XFC在改善AA大鼠行為及心肌組織超微結(jié)構(gòu)方面，優(yōu)于其余兩治療組。結(jié)論：AA大鼠可出現(xiàn)行為改變及心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，XFC既可以全面改善AA大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，同時(shí)也能改善其行為。

【關(guān)鍵詞】新風(fēng)膠囊;佐劑性關(guān)節(jié)炎;行為;心肌;大鼠

Objective:ToobservetheeffectsofXinfengCapsule(XFC),acompoundChineseherbalmedicine,onbehaviorsandmyocardialultrastructureinadjuvantarthritis(AA):Fiftyfiveratswererandomlydividedintonormalcontrolgroup,untreatedgroup,methotrexate(MTX)group,Tripterygiumwilfordiiglycosidestablet(TGT)groupandXFCgroup.Therewere11ratsineachgroup.Exceptforthoseinthenormalcontrolgroup,theratsintheothergroupswereallintracutaneouslygivenmlFreund‘scompleteadjuvantintherighthindlimb.Changesofbehaviorsandmyocardialultrastructureoftheratsindifferentgroupswere:Voixpedis‘swellingandarthritisindexinXFC,MTXandTPTgroupswereallobviouslyimprovedascomparedwiththeuntreatedgroup.AfterXFCtreatment,theautonomicactivitieswereobviouslyincreased,numberoferrorsinexerciseperiodandtestperiodwereobviouslydecreased,stepdownlatency(SDL)waslengthenedandescapelatency(EL)wasshortened.OverallstructureofmyocardialmyofibrilandthemajorityofcristaewasintactinXFCgroup.TheeffectsofXFCinimprovingthebehaviorsandmyocardialultrastructurewerebetterthanthoseofMTXand:ChangesofbehaviourandmyocardialultrastructureofAAratscanbeobserved.XFCcanimprovethemyocardialultrastructureofAAratsaswellastheirbehaviors.

Keywords:XinfengCapsule;adjuvantarthritis;behavior;myocardium;rats

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為特征的自身免疫性疾病。病變呈持續(xù)反復(fù)發(fā)作過程。RA嚴(yán)重影響患者的軀體健康。大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvantarthritis,AA)是研究RA的重要模型［1］，本研究采用AA大鼠動(dòng)物模型，觀察AA大鼠行為、心肌超微結(jié)構(gòu)的變化及健脾化濕通絡(luò)中藥新風(fēng)膠囊對(duì)其的影響，進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

1材料與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)雄性SD大鼠55只，購于安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，平均體質(zhì)量g，按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組、模型組、甲氨喋呤組、雷公藤多苷片組和新風(fēng)膠囊組。每組各11只。

藥品及試劑

XFC由安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院制劑中心提供，藥物主要由薏苡仁、黃芪、蜈蚣、雷公藤等組成。每粒膠囊含生藥浸出物g，院內(nèi)批號(hào)為20070129；MTX由上海醫(yī)藥有限公司信誼制藥總廠生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)為070104，mg/片；TGT為上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，生產(chǎn)批號(hào)為061102，10mg/片；弗氏完全佐劑、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥理研究所研制的大鼠跳臺(tái)儀、大鼠自發(fā)活動(dòng)測試箱和日本電子公司生產(chǎn)的JEM1230型透射電子顯微鏡等。

實(shí)驗(yàn)方法

動(dòng)物處理

除正常對(duì)照組外，其余各組動(dòng)物均右足跖皮內(nèi)注射FCAml制成佐劑性關(guān)節(jié)炎AA模型［2］。致炎后第19天開始給藥。XFC組：將XFC去除膠囊殼研成細(xì)末，加生理鹽水制成混懸液，按10ml/kg的劑量灌胃，1次/d；TGT組：將TGT研成細(xì)末，加生理鹽水制成混懸液，按10ml/kg的劑量灌胃，1次/d；MTX組：將MTX研成細(xì)末，加生理鹽水制成混懸液，按10ml/kg的劑量灌胃，每周1次，未給藥的實(shí)驗(yàn)日，給予生理鹽水灌胃，10ml/kg，1次/d；正常組及模型組予生理鹽水灌胃，10ml/kg，1次/d。各組療程均為30d。

足跖腫脹度測算

分別在造模前1天、致炎后第18天及給藥后每3d測量一次各組大鼠后足跖的容積，計(jì)算各組大鼠足跖腫脹度［3］。腫脹度=/Vn×100。

關(guān)節(jié)炎指數(shù)的計(jì)算

致炎后第12天開始觀察并記錄全身關(guān)節(jié)病變程度，每3d觀察1次。全身病變按5級(jí)評(píng)分法評(píng)價(jià)，根據(jù)未注射佐劑的其余3只肢體的病變程度累積積分，計(jì)算出關(guān)節(jié)炎指數(shù)［4］。0分：無紅腫；1分：小趾關(guān)節(jié)紅腫；2分：趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹；3分：踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4分：包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。把各個(gè)關(guān)節(jié)的積分累計(jì)起來，即為每只大鼠的AI。

大鼠行為學(xué)測定

跳臺(tái)法測定

根據(jù)李儀奎［5］法略加改進(jìn)。實(shí)驗(yàn)裝置為一個(gè)大小約45cm×30cm×50cm的有機(jī)玻璃箱，用黑色塑料板分隔成2間，底面是銅柵，間距為cm，可以通電，電壓由一變壓器控制。每間左后角置一高5cm、直徑8cm的橡膠平臺(tái)，作為大鼠回避電擊的安全區(qū)。將動(dòng)物放入反應(yīng)箱內(nèi)適應(yīng)環(huán)境3min，然后立即通36V交流電。動(dòng)物受到電擊，正常反應(yīng)是跳上平臺(tái)以躲避傷害性刺激。多數(shù)動(dòng)物會(huì)再次或多次跳至銅柵，受到電擊后又迅速跳回平臺(tái)。如此訓(xùn)練5min，大鼠受到電擊的次數(shù)為錯(cuò)誤次數(shù)。訓(xùn)練時(shí)觀察記錄大鼠受到電刺激后跳上平臺(tái)的時(shí)間，以此作為反應(yīng)時(shí)間。訓(xùn)練后24h進(jìn)行測驗(yàn)，將大鼠放于平臺(tái)上，底部柵板同時(shí)通電，記錄大鼠跳下平臺(tái)的時(shí)間，并記錄5min內(nèi)跳臺(tái)錯(cuò)誤次數(shù)。

自發(fā)活動(dòng)測試

實(shí)驗(yàn)在與計(jì)算機(jī)相連的專用圓形暗箱內(nèi)進(jìn)行，紅外探頭自動(dòng)記錄大鼠3min內(nèi)活動(dòng)次數(shù)，每只大鼠測3次，取平均值。

心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

參考文獻(xiàn)［6］觀察心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。動(dòng)物處死后，剪下心臟，從心尖向心底部切開，取左心室心尖部心肌組織各2塊，心肌每塊體積1mm×1mm×2mm；將組織塊置于%戊二醛中固定2h，經(jīng)磷酸緩沖液沖洗后，再用1%鋨酸后固定1h，經(jīng)丙酮逐級(jí)脫水，環(huán)氧樹脂Epon812包埋，超薄切片機(jī)切片，片厚70nm，先后經(jīng)枸櫞酸鉛和醋酸雙氧鈾染色，透射電子顯微鏡觀察。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS進(jìn)行單因素方差分析，組間比較用t檢驗(yàn)。P＜為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

各組大鼠體質(zhì)量、足跖腫脹度和AI的變化

致炎前各組大鼠的體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。致炎18d給藥前，與正常對(duì)照組相比，模型組、MTX組和TGT組大鼠體質(zhì)量顯著下降；給藥30d后，與模型組比較，正常對(duì)照組、TGT組和XFC組體質(zhì)量顯著升高，且XFC組大鼠體質(zhì)量明顯高于MTX和TGT組。見表1。致炎18d給藥前與正常對(duì)照組相比，模型組、TGT組、XFC組大鼠足跖腫脹度顯著升高，MTX組跖腫脹度升高；給藥30d后與模型組比較，正常對(duì)照組、MTX組和XFC組足跖腫脹度顯著下降，TGT組下降；與TGT組比較，正常組和MTX組足跖腫脹度顯著下降。見表1。致炎18d給藥前與正常對(duì)照組相比，各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著升高；給藥30d后與模型組相比，各組大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)均顯著降低，TGT組與MTX組和XFC組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。表1各組大鼠體質(zhì)量的變化表2各組大鼠足跖腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)的變化

各組大鼠行為的變化

與模型組相比，各組自主活動(dòng)明顯增加，跳臺(tái)訓(xùn)練期和測試期的錯(cuò)誤次數(shù)均明顯減少，SDL顯著延長而EL顯著縮短；XFC組SDL較MTX組顯著延長。見表3。表3各組大鼠行為的變化

各組大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變

正常對(duì)照組心肌細(xì)胞分界清晰，肌原纖維的明帶和暗帶分界清楚，肌絲結(jié)構(gòu)規(guī)則，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，線粒體結(jié)構(gòu)完整，肌漿網(wǎng)無擴(kuò)張。模型組心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體出現(xiàn)空泡樣變，心肌纖維破壞，閏盤結(jié)構(gòu)不完整，肌漿網(wǎng)擴(kuò)張。MTX組心肌細(xì)胞內(nèi)肌纖維紊亂，線粒體不清楚，有空泡樣變，肌漿網(wǎng)擴(kuò)張。TGT組心肌細(xì)胞少數(shù)線粒體有嵴紊亂，肌漿網(wǎng)有擴(kuò)張、空泡樣變。XFC組肌原纖維整體結(jié)構(gòu)尚完整，大部分嵴突完整，個(gè)別線粒體空泡樣變。見圖1。

3討論

RA是一種常見的以慢性多關(guān)節(jié)炎癥為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫性疾病，因其病程較長、致殘率高，不僅影響患者的生理健康，還嚴(yán)重影響患者的心理健康。RA常伴有抑郁癥狀。Dickens等［7］研究發(fā)現(xiàn)，超過80%的RA患者有抑郁情緒，15%的RA患者有嚴(yán)重的抑郁癥。國內(nèi)亦有調(diào)查表明，136例RA患者焦慮情緒患病率為%，抑郁情緒患病率為%［8］。研究表明心理疾病可引起一系列免疫功能的改變，而免疫功能的改變也可引起人和動(dòng)物情緒與行為的改變［9］。

臨床研究表明，RA的中醫(yī)基本病機(jī)是氣血不足、脾虛濕盛、痰瘀互結(jié)［10］。XFC具有益氣健脾、化濕通絡(luò)的功效。其中雷公藤具有免疫抑制作用，可抑制RA患者體內(nèi)異常免疫反應(yīng)；黃芪、薏苡仁與雷公藤相配一方面可以調(diào)節(jié)免疫，另一方面可以防止雷公藤免疫抑制作用大而造成機(jī)體免疫功能過于低下?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，黃芪富含黃酮、多糖、苷類和多種氨基酸，能增強(qiáng)免疫功能，調(diào)節(jié)糖代謝，加速受損組織修復(fù)，提高血清一氧化氮含量并抵抗心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)受損［11］。蜈蚣具有改善微循環(huán)、消除血栓、鎮(zhèn)靜止痛、抗炎和降壓等作用，可明顯改善心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)［12］。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明XFC能顯著改善AA大鼠的足跖腫脹，顯著降低AA大鼠的病變關(guān)節(jié)滑膜、胸腺、脾臟及胃黏膜細(xì)胞線粒體的病變率，對(duì)免疫器官及消化道有保護(hù)作用；XFC對(duì)AA大鼠綜合療效的作用機(jī)制可能與保護(hù)免疫器官，調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫功能，改善微循環(huán)等有關(guān)［13，14］。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，注射FCA后可引起AA大鼠行為學(xué)改變。XFC與MTX和TGT一樣能降低佐劑關(guān)節(jié)炎指數(shù)和足跖腫脹度，說明其具有抑制炎癥作用。實(shí)驗(yàn)表明XFC能明顯延長大鼠跳臺(tái)錯(cuò)誤潛伏期，減少其錯(cuò)誤次數(shù)；明顯減少大鼠被電擊的次數(shù)，顯著縮短大鼠尋找平臺(tái)的潛伏期，延長大鼠在平臺(tái)停留的時(shí)間。說明XFC對(duì)AA大鼠的行為有明顯改善作用。XFC組心肌肌原纖維及嵴突整體結(jié)構(gòu)完整，MTX和TGT組心肌細(xì)胞內(nèi)有線粒體嵴紊亂或斷裂，肌漿網(wǎng)有擴(kuò)張、空泡樣變。XFC在全面改善AA大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的同時(shí)也可改善其行為。

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