慢性髓系白血病首發(fā)血小板顯著增多

慢性髓系白血病首發(fā)血小板顯著增多【摘要】本研究探討以血小板顯著增多首發(fā)的慢性髓系白血病(CML)臨床、細(xì)胞遺傳學(xué)及分子生物學(xué)特征。應(yīng)用骨髓細(xì)胞涂片、骨髓活檢觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變；RT-PCR檢測(cè)bcr/abl融合基因；常規(guī)染色體核型分析及FISH檢測(cè)細(xì)胞遺傳學(xué)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：以血小板顯著增多為首發(fā)表現(xiàn)的CML是一組具有獨(dú)特臨床和生物學(xué)特點(diǎn)的疾病，骨髓細(xì)胞涂片和骨髓活檢表明，骨髓增生活躍，以巨核系異常增生為主，血小板大片成堆，可見(jiàn)圓形核小巨核細(xì)胞，中等度白細(xì)胞增多，經(jīng)細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)均證實(shí)存在有Ph染色體和表達(dá)bcr/abl融合基因，對(duì)此類患者應(yīng)該早期進(jìn)行積極治療，甚至進(jìn)行分子生物學(xué)水平的干預(yù)；而原發(fā)性血小板增多癥患者則不宜過(guò)多地使用化療藥物，否則反而誘致白血病的發(fā)生。結(jié)論：對(duì)血小板明顯增多的患者應(yīng)及時(shí)進(jìn)行Ph染色體及bcr/abl融合基因表達(dá)水平的檢測(cè)，這對(duì)于ET及CML的診斷和鑒別診斷極為重要，以避免誤診、誤治。

【關(guān)鍵詞】原發(fā)性血小板增多癥

ChronicMyeloidLeukemiaOnsetwithMarkedThrombocythemia

AbstractThisstudywasaimedtoinvestigatetheclinical，pathologicalandbiologicalfeaturesofaspecialcaseofchronicmyeloidleukemia(CML)withmarkedthrombocythemiconset.Themorphologicalchangesofcellswereanalyzedbyusingbonemarrowsmearandbiopsy;Phchromosome，aspecificmarkerofCML，wasassayedbyconventionalchromosomalanalysisandfluorescenceinsituhybridization，bcr/ablfusiongenewasdetectedbyreversetranscription-polymerasechainreaction.TheresultsindicatedthatCMLmimickedessentialthrombocythemia(ET)atpresentationwasrelativelyrareandmightbemisdiagnosedasET，bonemarrowsmearandbiopsyrevealed，markedthrombocytosisandmoderateleukocytosis;RT-PCR，F(xiàn)ISHandconventionalchromosomalanalysisdemonstratedtheexistanceofPhchromosomeandbcr/ablfusionspecialCMLcouldprogressintoacceleratedphaseorblastmegakaryocytesinPh+ETweresmallerthannormalonesandhadtypicallyhypolobulatedrounddiagnosedasPh+ETmightprogressintoCMLandshowedahightendencytomyelofibrosisandblastictransformation.ItisconcludedthatthevalueofroutinecytogeneticalandmolecularbiologicalanalysisindiagnosisforpotentialCMLcases，whichmimickedETasinthispresentation，isverydistinctive，andtheimportanceismagnifiedbytherecentavailabilityofimatinib，aspecificinhibitorofthebcr/abltyrosinekinaseproducedbythePhiladelphiacaseof“ET”shouldbetestedforthePhiladelphiachromosomeandbcr/abltranscript.

Keywordsessentialthrombocythemia；chronicmyeloidleukemia；Phchromosome；bcr/ablfusiongene

原發(fā)性血小板增多癥和慢性髓系白血病屬于骨髓增殖性疾病(myeloproliferativedisorder，MPD)家族，但兩者發(fā)病時(shí)的表現(xiàn)通常不同，自然病程也不同。最新的資料表明，每個(gè)擬診ET的病例必須進(jìn)行Ph染色體的分析［1］。世界衛(wèi)生組織的診斷標(biāo)準(zhǔn)也明確，ET的診斷必須排除Ph染色體及bcr/abl融合基因陽(yáng)性［2］。因?yàn)镋T和CML的鑒別診斷非常重要，且對(duì)采用Ph染色體基因產(chǎn)物靶向治療的有效性更具指導(dǎo)意義。本研究通過(guò)實(shí)例探討以血小板顯著增多為主要表現(xiàn)CML的細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)特征，從而提高對(duì)ET及CML的認(rèn)識(shí)，以免誤診、誤治。

材料和方法

病例

患者，女，34歲。因“發(fā)現(xiàn)血小板增多2月，頭昏、乏力2天”，于2005年5月收治入院?；颊?月前因腰痛、雙手指瘙癢在外院就診。當(dāng)時(shí)血常規(guī)檢查顯示：WBC12×109/L，Hbg/L，Plt2524×109/L。骨髓檢查：巨核細(xì)胞824個(gè)，產(chǎn)血小板巨核細(xì)胞315個(gè)，血小板成堆可見(jiàn)，考慮為“ET”。予羥基脲口服月，血小板基本恢復(fù)正常。近2天來(lái)患者自覺(jué)乏力、惡心、納差、腰痛而來(lái)我院就診。入院當(dāng)天血常規(guī)檢查：WBC×109/L，N86%，L11%，E1%，B2%，Hb51g/L，Plt2365×109/L。大便隱血(+)。骨髓常規(guī)及骨髓活檢提示巨核系異常增生，巨核細(xì)胞體積較小，多為不分葉圓核型；常規(guī)染色體核型分析、FISH及RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Ph染色體及bcr/abl融合基因；多次中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶(NAP)積分明顯減低；嗜堿性粒細(xì)胞比例增高。診斷：慢性髓系白血病、上消化道出血。

細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)

骨髓細(xì)胞涂片常規(guī)瑞氏染色后，光鏡下計(jì)數(shù)250個(gè)有核細(xì)胞，分析各階段細(xì)胞形態(tài)及比例；全片計(jì)數(shù)巨核細(xì)胞，并分析100個(gè)巨核細(xì)胞形態(tài)。同時(shí)分析外周血涂片，并進(jìn)行白細(xì)胞分類及血小板形態(tài)分析。

骨髓活檢

以10%福爾馬林固定骨髓活檢標(biāo)本，常規(guī)石蠟包埋、切片、伊紅染色，光鏡下分析骨髓組織細(xì)胞分布及構(gòu)成。

細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)

常規(guī)骨髓細(xì)胞染色體核型分析抽取肝素抗凝的骨髓5ml，計(jì)數(shù)后按×106/ml進(jìn)行直接法制備染色體標(biāo)本，然后進(jìn)行R顯帶處理。每例平均分析20個(gè)細(xì)胞，按《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制[ISCN(1995)］進(jìn)行核型描述，每例標(biāo)本的核型至少需經(jīng)2人共同鑒定。剩余的細(xì)胞懸液儲(chǔ)存于-20℃，供FISH檢測(cè)。

骨髓染色體制備

①用%肝素濕潤(rùn)之針筒抽取骨髓，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)，將骨髓按×106/ml，加入20mlRPMI1640培養(yǎng)液，37℃恒溫箱放置24小時(shí)；②加入秋水仙堿，終濃度為μg/ml，于37℃放置1小時(shí)；③離心：200×g×10分鐘，棄上清液；④低滲：加入預(yù)溫至37℃的mol/LKCl液8ml，輕輕打勻，于37℃放置30分鐘；⑤預(yù)固定：加入1ml固定液輕輕打勻，200×g×10分鐘；⑥第1次固定：離心后棄上清液，加固定液8ml，打勻，于室溫放置≥30分鐘；⑦第2次固定：200×g×10分鐘，離心后棄上清液，加固定液8ml，打勻，于室溫放置≥15分鐘；⑧第3次固定：200×g×10分鐘，離心后棄上清液，加固定液8ml打勻，室溫放置≥15分鐘；⑨離心：200×g×10分鐘，棄上清，加適量固定液配成細(xì)胞懸液，于4℃保存；⑩氣干法制片后，10%姬姆薩染色20分鐘，水洗，干后鏡檢。

熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH)①探針制備：采用BCR/ABL雙色探針，BCR結(jié)合綠色熒光SpectrumGreen，ABL結(jié)合紅色熒光SpectrumRed，探針購(gòu)自美國(guó)Vysis公司；②間期FISH：取出儲(chǔ)存于-20℃的染色體標(biāo)本，換用新鮮的3∶1甲醇/冰醋酸固定液，氣干法滴片；37℃2×SSC中30分鐘老化，70%、85%、100%的乙醇室溫下梯度脫水，每梯度2分鐘；在變性液中72℃變性3分鐘，70%、85%、100%的冰乙醇梯度脫水，晾干。按1μlBCR/ABL雙色探針加4μl雜交稀釋液加入Eppendorf管中，瞬時(shí)離心混勻.把探針與稀釋液的Eppendorf管放入72℃水浴鍋中變性5分鐘。按每張玻片加5μl的反應(yīng)體系后，將該玻片蓋緊，用膠封牢后置37℃濕盒中雜交過(guò)夜，將雜交后的片子放于72℃，%TritonX-100/×SSC中洗滌2分鐘，繼之用%TritonX100/2×SSC室溫洗滌1分鐘。避光晾干后按每片加6μlDAPI/Antifade復(fù)染。③熒光顯微鏡檢查：用OlympusBX60熒光顯微鏡，在DAPI/FITC/TexasRed濾色鏡的激發(fā)下觀察間期細(xì)胞的熒光雜交信號(hào)，每例分析200-300個(gè)細(xì)胞，不計(jì)數(shù)重疊細(xì)胞。以患者3個(gè)或1個(gè)熒光雜交信號(hào)的百分率大于每種探針對(duì)照組X＋3SD作為克隆性異常的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)。用KodakEktapressPJC800負(fù)片攝片或應(yīng)用染色體圖像及多彩色熒光原位雜交自動(dòng)分析儀進(jìn)行圖像采集和分析。

分子生物學(xué)檢測(cè)

RT-PCRRNA抽提試劑TRIZOL、Taq酶、oligodT(36)AGC、引物合成由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司提供；M-MLV、dNTPs(Promega公司)；陽(yáng)性對(duì)照K562細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。TRIZOL一步法提取患者骨髓細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計(jì)(BeckmanDU650)檢測(cè)定量之后將RNA統(tǒng)一稀釋成1μg/μl。RT反應(yīng)：取RNA2μl(2μg)，oligodT(36)AGC3μl，ddH2O9μl混勻離心，70℃，4分鐘，放置冰上3分鐘，離心之后冰浴條件下加入5×緩沖液6μl，dNTPs1μl，M-MLVμl，ddH2Oμl，總體積為30μl，42℃90分鐘后，70℃5分鐘滅活反轉(zhuǎn)錄酶。PCR反應(yīng)：取RT產(chǎn)物2μl，引物各μl，5mmol/LdNTPs1μl，10×擴(kuò)增緩沖液(無(wú)MgCl2)5μl，25mmol/LMgCl27μl，Taq酶μl，以ddH2O將體積補(bǔ)充到50μl，混勻，置PCR儀上。95℃預(yù)變性5分鐘之后，95℃變性45秒，60℃退火45秒，72℃延伸45秒，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。bcr/abl引物序列：bcr引物序列為5’-CTCCAGACTGTCCACAGCATTCCG-3′，abl引物序列為3’-AGACTGAAACTCGGAGTCCCAGAC-5’，abl反義引物序列為3’-TTCGGGAAGTCGCCGGTCATCGT-5’。根據(jù)bcr/abl不同拼接方式，可產(chǎn)生168bp(b3a2)和93bp(b2a2)兩種轉(zhuǎn)錄本。β-actin(271bp)為內(nèi)對(duì)照，引物序列：有義鏈：5’-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3’，反義鏈：5’-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3’。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外照相。

結(jié)果

骨髓涂片及骨髓活檢結(jié)果

骨髓細(xì)胞涂片骨髓增生明顯活躍，?！眉t=；巨核細(xì)胞530個(gè)，分類100個(gè)，產(chǎn)血小板巨核細(xì)胞42個(gè)，血小板成堆大片易見(jiàn)，可見(jiàn)圓形核小巨核細(xì)胞。外周血涂片見(jiàn)多量大簇血小板，積聚成大片。鐵染色：胞外鐵陰性，胞內(nèi)鐵陰性。NAP陽(yáng)性率30%，積32分。1月后復(fù)查骨髓：骨髓增生活躍，粒系%，紅系24%，?！眉t=；巨核細(xì)胞60個(gè)，產(chǎn)血小板巨核細(xì)胞15個(gè)，可見(jiàn)小巨核細(xì)胞，血小板大簇易見(jiàn)。NAP陽(yáng)性率19%，積19分。

骨髓活檢

造血組織增生異常，以巨核系異常增生為主。造血組織∶脂肪∶骨小梁為52%∶22%∶24%。巨核細(xì)胞較小，多為不分葉圓核型。

RT-PCR結(jié)果

分別兩次骨髓樣本RT-PCR結(jié)果：bcr/abl融合基因陽(yáng)性，b3a2型。

染色體核型分析及FISH結(jié)果

骨髓細(xì)胞染色體核型分析：46XX，t(9;22)(q34;q11)［10］。間期FISH證實(shí)存在Ph染色體。

治療

入院后立即予治療性血小板單采以及控制消化道出血、補(bǔ)鐵等其他對(duì)癥處理，并予羥基脲治療，但患者用藥后嘔吐頻繁被迫停藥。為有效控制血小板數(shù)，曾予小劑量HA聯(lián)合治療[高三尖杉酯堿1mg/d，阿糖胞苷10mg/12hours］，10天后血常規(guī)示：WBC×109/L，N69%，L27%，M4%，Hb61g/L，plt542×109/L。以后常規(guī)皮下注射-干擾素300萬(wàn)單位，隔日1次，血小板數(shù)控制在430×109/L左右，目前單用干擾素維持。貧血經(jīng)補(bǔ)鐵治療后明顯改善。門診隨訪半年，病情穩(wěn)定，貧血完全糾正，血小板數(shù)正常。

討論

原發(fā)性血小板增多癥是一種慢性骨髓增殖性疾病，其血小板增高并不是其他MPD的發(fā)病原因，也不是診斷性癥狀。由真性紅細(xì)胞增多癥研究小組提議的診斷標(biāo)準(zhǔn)，包括無(wú)Ph染色體或分子等價(jià)值的bcr/abl轉(zhuǎn)錄本［3］。Ph染色體是CML的標(biāo)志，它是由9號(hào)染色體和22號(hào)染色體長(zhǎng)臂之間的交互易位所引起的，即[t(9;22)(q34;q11)］，斷裂的bcr和abl基因形成嵌合的bcr/abl轉(zhuǎn)錄本，而該mRNA編碼具有轉(zhuǎn)化能力的融合蛋白極可能是CML的基礎(chǔ)，中位總生存時(shí)間為5年。而ET預(yù)后較好，患者的總生存時(shí)間與正常人群并無(wú)明顯差異。CML和ET的治療及預(yù)后相當(dāng)不同，進(jìn)行兩者間的鑒別診斷是非常必要的。盡管如此，對(duì)某些病例的評(píng)估和界定仍很難，因?yàn)闃O少數(shù)CML最初診斷時(shí)僅有血小板增高，有或沒(méi)有Ph染色體的表達(dá)［3-6］；而少數(shù)ET患者外周血白細(xì)胞中可檢測(cè)到bcr/abl轉(zhuǎn)錄本，但其表達(dá)水平明顯低于CML患者，且Ph染色體陰性［7］。

本例患者首發(fā)表現(xiàn)為典型的ET，包括持續(xù)非常高的血小板計(jì)數(shù)；無(wú)脾腫大，白細(xì)胞明顯增多；外周血片及骨髓細(xì)胞分類無(wú)明顯中幼粒細(xì)胞和晚幼粒細(xì)胞異常增生等。而多次NAP染色積分明顯減低；骨髓常規(guī)檢查結(jié)果和骨髓活檢以及細(xì)胞和分子水平發(fā)現(xiàn)的Ph染色體及bcr/abl融合基因等均支持CML的診斷。該類患者做出最后診斷時(shí)需與ET相鑒別。WHO有關(guān)ET確定診斷的定義為：血小板持續(xù)在600×109/L以上，骨髓活檢顯示以巨核系增生為主，大成熟巨核細(xì)胞增多［2］。ET患者的最大威脅是血栓或不常出現(xiàn)的出血并發(fā)癥，大多可為有效的治療所預(yù)防，遠(yuǎn)期療效好，壽命近乎正常［8］。與CML相比，在沒(méi)有引致白血病的化療下，僅有5%的患者進(jìn)展為急性白血病。由此可見(jiàn)，ET的患者不宜過(guò)多地使用化療藥物，否則反而誘致白血病的發(fā)生，這是極其重要而關(guān)鍵的問(wèn)題，必須引起臨床醫(yī)師的高度重視［9］。相反，疑似血小板顯著增多為首發(fā)表現(xiàn)的CML患者，一旦經(jīng)細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)證實(shí)存在Ph染色體和表達(dá)bcr/abl融合基因，應(yīng)該早期進(jìn)行積極治療，甚至分子生物學(xué)水平的干預(yù)。因?yàn)閹缀跛蠧ML患者在5年以內(nèi)進(jìn)展為致死性的急性白血病，而新的靶向性分子治療使這種狀況得到了很大的改善。某些ET和CML表現(xiàn)并不典型，出現(xiàn)重疊特征。在分類上的挑戰(zhàn)，很容易通過(guò)證明是否存在Ph染色體易位的bcr/abl融合基因而得以解決［10，11］。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于診斷時(shí)僅有血小板增高而常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)分析有或沒(méi)有Ph染色體的表達(dá)的CML，應(yīng)用特異性更強(qiáng)的FISH等技術(shù)定期跟蹤檢測(cè)Ph染色體、bcr/abl融合基因就顯得尤為重要［12］。

Rice等［1］最近報(bào)道了2例具有絕對(duì)典型ET特征的女性患者，包括極度的血小板增多，無(wú)白細(xì)胞增多，無(wú)嗜鹼性細(xì)胞，無(wú)外周不成熟細(xì)胞，無(wú)脾腫大。該研究小組認(rèn)為CML可呈現(xiàn)典型的ET表現(xiàn)，盡早采用常規(guī)Ph染色體檢測(cè)將使靶向治療的有效性以及早期治療的優(yōu)效性更加明顯［3］。但所推薦標(biāo)準(zhǔn)并未被臨床醫(yī)師所重視，而僅在進(jìn)展為加速期時(shí)，為確立CML的診斷方才實(shí)施染色體的檢測(cè)。專家建議，CML存在的線索可為骨髓中嗜鹼性細(xì)胞3%和小而不典型的巨核細(xì)胞［4］。本研究介紹患者在骨髓常規(guī)和骨髓活檢中均發(fā)現(xiàn)較多的不分葉圓核小巨核細(xì)胞，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

值得關(guān)注的是，CML在整個(gè)早期臨床病程中其臨床表現(xiàn)在各方面可與ET很相似，主要出現(xiàn)嚴(yán)重的血栓并發(fā)癥。甲磺酸伊馬替尼早期使用便可能更快速地控制血小板數(shù)，防止血栓并發(fā)癥，并免于氯咪喹酮和羥基脲的毒性；在疾病加速之前，盡早啟用伊馬替尼可改善預(yù)后，且可避免實(shí)施骨髓移植的需要［11，13］。真性紅細(xì)胞增多癥研究組近來(lái)不斷強(qiáng)調(diào)有ET表現(xiàn)時(shí)須進(jìn)行bcr/abl的分子檢測(cè)［14］。在表型為CML的情況下，DNA或RNA探針能檢出相對(duì)不常見(jiàn)的bcr/abl易位，而此可為常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)所遺漏。

bcr/abl融合基因作為CML的主要標(biāo)志，能否在ET患者中檢測(cè)到尚存在爭(zhēng)議［15］。Hsu等［7］應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)了63例MPD患者以及51例健康志愿者外周血bcr/abl融合基因在mRNA的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4/30例ET(%)，17/17例CML(100%)，0/16例PV(0%)以及1/51健康者(%)具有bcr/abl轉(zhuǎn)錄本。進(jìn)一步的半定量PCR分析顯示，bcr/abl轉(zhuǎn)錄本在1例正常人及4例ET患者的表達(dá)強(qiáng)度為CML患者的1/1000至1/10000。由此可得出，Ph染色體陰性的ET患者外周血白細(xì)胞中可檢測(cè)到bcr/abl轉(zhuǎn)錄本，但其表達(dá)水平遠(yuǎn)低于CML患者。Damaj等［16］通過(guò)大宗研究資料試圖驗(yàn)證一種新的變異性ET的假設(shè)。他們分析ET患者121例。多重RT-PCR檢測(cè)bcr/abl轉(zhuǎn)錄本，僅有2例bcr/abl陽(yáng)性，且在診斷時(shí)有輕度嗜堿粒細(xì)胞增多。由此可見(jiàn)，bcr/abl轉(zhuǎn)錄本在確診為ET的患者中是極為罕見(jiàn)的，典型的ET不表達(dá)bcr/abl融合基因。有明顯ET和嗜堿粒細(xì)胞增多的少數(shù)患者極可能是CML和典型ET間一種新的中間狀態(tài)，更好地深入開展bcr/abl表達(dá)“ET”的臨床和生物學(xué)特征的前瞻性研究是非常重要的。

Michiels等［17］對(duì)23例曾描述為Ph+的ET患者的臨床癥狀、血液學(xué)特征以及自然病程進(jìn)行了評(píng)估。23例的骨髓涂片及活檢中出現(xiàn)小的單個(gè)核巨核細(xì)胞，與反應(yīng)性血小板增多相比，Ph+血小板增多者巨核細(xì)胞更小，典型的為不分葉圓核型。與Ph-的真正的血小板增多癥具有成簇的成熟而增大的巨核細(xì)胞相比則相反。Ph+血小板增多患者顯示骨髓纖維化和白血病轉(zhuǎn)化的高趨勢(shì)。這提示Ph+血小板增多和CML相關(guān)的Ph+血小板增多均可被認(rèn)作是CML慢性期的早期表現(xiàn)。

綜上所述，為典型的ET患者建立常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)體系，并觀察確認(rèn)CML的可能，對(duì)于采取適當(dāng)?shù)某跏贾委熂案鶕?jù)所預(yù)期的不同結(jié)果進(jìn)行早期干預(yù)是十分必要的。

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