精選生化分析儀檢測原理講義

（優(yōu)選）生化分析儀檢測原理課件目前一頁\總數(shù)五十九頁\編于八點全自動生化分析儀.*目前二頁\總數(shù)五十九頁\編于八點生化分析儀特點優(yōu)點亮點自動化機械化的儀器設(shè)備模仿代替手工操作提高了工作效率減少了主觀誤差靈敏準確快速標準化.*目前三頁\總數(shù)五十九頁\編于八點生化分析儀分類1按結(jié)構(gòu)原理分管道連續(xù)流動式分立式——常用離心式干片式——急診常用2按測定速度分小型中型大型超大型（模塊式）3按自動化程度分半自動全自動.*目前四頁\總數(shù)五十九頁\編于八點2004??????生化分析儀主要構(gòu)成加樣系統(tǒng)供排水系統(tǒng)構(gòu)成比色系統(tǒng)光源比色杯單色器檢測器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)樣品轉(zhuǎn)盤試劑倉取樣裝置.*目前五頁\總數(shù)五十九頁\編于八點基本原理臨床生化分析儀最常使用的是——分光光度法分光光度法——是通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度，對該物質(zhì)進行定性和定量分析的方法。

.*目前六頁\總數(shù)五十九頁\編于八點.*目前七頁\總數(shù)五十九頁\編于八點.*目前八頁\總數(shù)五十九頁\編于八點Lambert-Beer（朗伯-比爾）定律

當一束平行單色光通過均勻的非散射樣品時，樣品對光的吸光度與樣品的濃度及厚度成正比

A=kcb

A---吸光度k---吸光系數(shù)c---溶液濃度b---液層厚度.*目前九頁\總數(shù)五十九頁\編于八點吸光系數(shù)

定義：吸光物質(zhì)在單位濃度及單位厚度時測得的吸光度。K值的大小取決于吸光物質(zhì)的性質(zhì)、入射光波長、溶液溫度和溶劑性質(zhì)等，與溶液濃度大小和液層厚度無關(guān)。但K值大小因溶液濃度所采用的單位的不同而異。.*目前十頁\總數(shù)五十九頁\編于八點討論：1.Lamber-Beer定律的適用條件（前提）:入射光為單色光溶液是均勻，無散射溶液2.該定律適用于固體、液體和氣體樣品3.在同一波長下，各組分吸光度具有加和性，如果溶液中同時存在兩種或兩種以上的吸光性物質(zhì),則測得的該溶液的吸光度等于溶液中各吸光性物質(zhì)吸光度的總和，即：

A（a+b+c）＝Aa＋Ab＋Ac應(yīng)用：多組分測定.*目前十一頁\總數(shù)五十九頁\編于八點定量分析方法(1)標準曲線法(2)標準溶液對比法(3)吸光系數(shù)法.*目前十二頁\總數(shù)五十九頁\編于八點標準曲線法——最經(jīng)典方法

前提：固定儀器和固定條件A=K*BC過程：配置標準溶液系列→分別測定A→得C~A曲線樣品→測定A樣→

查得C樣.*目前十三頁\總數(shù)五十九頁\編于八點標準溶液對比法在相同的條件下，配制濃度為cs的標準溶液和濃度為cx的樣品溶液，在最大吸收波長處，分別測定二者的吸光度值為As、Ax

，依據(jù)朗伯-比爾定律得:As=KbcsAx=Kbcx

則:cx=cs*Ax/AsX.*目前十四頁\總數(shù)五十九頁\編于八點吸光系數(shù)法吸光系數(shù)法又稱絕對法，是直接利用朗伯-比爾定律的數(shù)學(xué)表達式A＝Kbc進行計算的定量分析方法。在手冊中查出待測物質(zhì)在最大吸收波長處的吸光系數(shù)或,并在相同條件下測量樣品溶液的吸光度A，則其濃度為：

或.*目前十五頁\總數(shù)五十九頁\編于八點檢測方法1.終點法

2.固定時間法3.連續(xù)監(jiān)測法

.*目前十六頁\總數(shù)五十九頁\編于八點終點法終點分析法是基于反應(yīng)達到平衡時反應(yīng)產(chǎn)物的吸收光譜特征及其對光吸收強度的大小，對物質(zhì)進行定量的一類分析方法。反應(yīng)混合物進行一定時間反應(yīng)后，達到平衡終點，即在顯色反應(yīng)處于穩(wěn)定階段時，監(jiān)測其顏色對光的吸收強度，以此計算待測物濃度。終點時間的確認：一、根據(jù)時間-吸光度曲線如:Trinder（偶聯(lián)終點比色法）反應(yīng)測尿酸，反應(yīng)曲線上3-5分鐘時其A趨向穩(wěn)定,故可將5分鐘作為反應(yīng)終點。二、根據(jù)被測物反應(yīng)終點，結(jié)合干擾物的反應(yīng)情況來確定如:溴甲酚綠法測血清白蛋白

.*目前十七頁\總數(shù)五十九頁\編于八點分類終點法：一點終點法二點終點法免疫比濁法雙波長法.*目前十八頁\總數(shù)五十九頁\編于八點一點終點法一點終點法——在時間-吸光度曲線上吸光度不再改變時，選擇一個時間點測定吸光度值。通常在反應(yīng)終點附近連續(xù)讀兩個吸光度，求出兩點的平均值，并根據(jù)兩點的差值判斷反應(yīng)是否達到平衡。.*目前十九頁\總數(shù)五十九頁\編于八點一點終點法的設(shè)置：以R和S混合之前的空氣空白、水空白或試劑空白的吸光度值為測定計算基點，以反應(yīng)達到平衡的吸光度讀數(shù)減去空白讀數(shù)，校準曲線通過零點且成直線，對于反應(yīng)速度比較快的實驗多用。多見于單試劑項目，如：總蛋白，白蛋白等。.*目前二十頁\總數(shù)五十九頁\編于八點2023/5/2521Am

T（時間）AS+R(吸光度）一點終點法反應(yīng)曲線

計算公式：C=(Am-Ab)*KAm----終點讀數(shù)點的吸光Ab----試劑空白吸光度K----校正系數(shù).*目前二十一頁\總數(shù)五十九頁\編于八點TP反應(yīng)曲線蛋白質(zhì)+Cu2+→Cu-蛋白質(zhì)絡(luò)合物550nm處吸收峰.*目前二十二頁\總數(shù)五十九頁\編于八點

二點終點法第二試劑加入以前，選擇某一點讀取吸光度Am，經(jīng)過一定時間后反應(yīng)達終點后測第二個吸光度值A(chǔ)n,利用兩吸光度之差計算結(jié)果。第一點吸光度值由樣本本身或第一試劑與樣品的非特異性反應(yīng)有關(guān)，相當于樣品空白，可有效的消除樣品自身的吸光度，如溶血，黃疸，脂血等的干擾。.*目前二十三頁\總數(shù)五十九頁\編于八點AnTAR2AmS+R1(吸光度）（時間）兩點終點樣本空白=S+R1S+R1+R2（體積校正因子）k0

計算公式

C=(An-K0*Am)*K

.*目前二十四頁\總數(shù)五十九頁\編于八點CRE反應(yīng)曲線肌酐在一系列酶的作用下生成H2O2，H2O2和4-氨基氨替比林反應(yīng)生成紅色醌類物質(zhì)，在540nm處有吸收峰。.*目前二十五頁\總數(shù)五十九頁\編于八點Mg反應(yīng)曲線在堿性溶液中，Mg與二甲苯胺藍形成重氮鹽類的紫色復(fù)合物，Mg2+濃度可由二甲苯胺藍吸光度的下降，通過光度測定法來測定。.*目前二十六頁\總數(shù)五十九頁\編于八點免疫比濁法

通過物質(zhì)對光的散射或透射來測定物質(zhì)含量的方法：散射比濁：特定蛋白分析儀透射比濁：自動生化分析儀通常作兩點終點法分析，多采用多點校準。應(yīng)用：用Ab測定Ag（主要為微量蛋白：IG、C、APOA1/B、ASO、RF、CRP等），要求Ab過量，此時Ag-Ab復(fù)合物的生成量隨Ag的增加而遞增，光散/透射強度與抗原量成正比。.*目前二十七頁\總數(shù)五十九頁\編于八點免疫比濁法優(yōu)點：方法簡便結(jié)果準確可用于自動化儀器檢測缺點：抗體用量大達平衡時間長.*目前二十八頁\總數(shù)五十九頁\編于八點雙波長法消除樣品中對測定有干擾的物質(zhì)的影響；在試樣中含有兩個組分a和b時，若要測定組分b,組分a有干擾，應(yīng)設(shè)法消除組分a的吸收干擾。首先選擇待測組分b的最大吸收波長λ1作為測量波長，然后用作圖的方法選擇參比波長λ2，使組分a在這兩個波長處的吸光度相等。試樣溶液在λ2和λ1兩個波長處的吸光度之差，只與待測組分的濃度成正比，而與干擾組分的濃度無關(guān).*目前二十九頁\總數(shù)五十九頁\編于八點干擾物質(zhì)1.脂血：吸收光譜300--600nm呈下降趨勢2.Hb：350nm、400nm、540nm、580nm吸收峰3.膽紅素：300--500nm有吸收峰可見它們的吸收峰都較寬，且同測定波長有重疊現(xiàn)象。.*目前三十頁\總數(shù)五十九頁\編于八點雙波長法雙波長測定優(yōu)點：

①消除噪音干擾②減少雜散光影響③減少樣品本身光吸收的干擾

.*目前三十一頁\總數(shù)五十九頁\編于八點固定時間法指在時間-吸光度曲線上選擇兩個測光點，這兩點既非反應(yīng)初始吸光度亦非終點吸光度，利用這兩點吸光度差值計算結(jié)果。如：苦味酸法測肌酐計算公式：

C=(A2-A1)*KA1A2·●T(吸光度）●.*目前三十二頁\總數(shù)五十九頁\編于八點

測定底物的消耗或產(chǎn)物生成的速度的化學(xué)方法稱為連續(xù)監(jiān)測法（又稱動態(tài)分析法、速率法或動力學(xué)法）。在反應(yīng)速度恒定期（零級反應(yīng)期）來連續(xù)觀察和記錄一定反應(yīng)時間內(nèi)底物或產(chǎn)物量的變化。通過測定一段時間內(nèi)吸光度的變化速率（△A/min）來計算待測物的濃度。

酶活性測定如（ALT、AST、ALP、GGT等）常用連續(xù)監(jiān)測法（速率法）.*目前三十三頁\總數(shù)五十九頁\編于八點酶促反應(yīng)曲線.*目前三十四頁\總數(shù)五十九頁\編于八點連續(xù)監(jiān)測法即零級反應(yīng)速率法,亦稱斜率法在較長反應(yīng)時間區(qū)段內(nèi)(90-180秒)，每隔一定時間(5~30秒)讀取一次吸光度值，至少讀取4點，得到3個以上△A，最后算出反應(yīng)速率△A/min。.*目前三十五頁\總數(shù)五十九頁\編于八點.*目前三十六頁\總數(shù)五十九頁\編于八點酶促反應(yīng)進程曲線.*目前三十七頁\總數(shù)五十九頁\編于八點2023/5/2538A1TAS+R1R2A2(吸光度）（時間）連續(xù)監(jiān)測法A/min=[(A2-A1)-(空白)]/(t2-t1)t2t1.*目前三十八頁\總數(shù)五十九頁\編于八點連續(xù)監(jiān)測法特點與固定時間法相比，屬于即時觀測，無需停止酶促反應(yīng)、不需添加其他呈色試劑，且可將多點的測定結(jié)果繪圖連線，快速、直觀查看酶促反應(yīng)進程，很容易找到呈直線的線性期，檢查到是否偏離零級反應(yīng)。.*目前三十九頁\總數(shù)五十九頁\編于八點典型酶聯(lián)法反應(yīng)曲線.*目前四十頁\總數(shù)五十九頁\編于八點ALT反應(yīng)曲線.*目前四十一頁\總數(shù)五十九頁\編于八點AMY反應(yīng)曲線.*目前四十二頁\總數(shù)五十九頁\編于八點生化結(jié)果報告審核責(zé)任心不強，未對結(jié)果進行認真審核對檢測儀器或試劑方法學(xué)不夠了解工作經(jīng)驗不足對儀器檢測的結(jié)果及室內(nèi)質(zhì)控結(jié)果過于相信.*目前四十三頁\總數(shù)五十九頁\編于八點1.結(jié)合質(zhì)控判斷結(jié)果在控在控GLO=TP—ALB偏高.*目前四十四頁\總數(shù)五十九頁\編于八點2.結(jié)合臨床資料審核結(jié)合病人的性別、年齡、臨床診斷、其他檢查結(jié)果審核

例：某病人檢測的TP為110g/L，該標本沒有脂血等影響檢測結(jié)果的因素臨床診斷：多發(fā)性骨髓瘤

另：胰島素與低血糖、病人輸注藥物對結(jié)果的影響.*目前四十五頁\總數(shù)五十九頁\編于八點檢驗項目間的內(nèi)在聯(lián)系各檢測參數(shù)間存在大小、比例、邏輯關(guān)系例：TC>HDL-C+LDL-C、TBI>DBICK>CK-MB

LDH>α-HBDH.*目前四十六頁\總數(shù)五十九頁\編于八點影響檢驗結(jié)果的因素

試劑線性范圍：

了解檢驗項目試劑的線性范圍，對超過或低于范圍的項目，必須進行相應(yīng)的減量稀釋或增量后重新測定。.*目前四十七頁\總數(shù)五十九頁\編于八點線性范圍

在實際工作中，用連續(xù)監(jiān)測法會遇到檢驗結(jié)果為0或者負值的情況，此時不能盲目相信該結(jié)果低就出具低值報告，應(yīng)查看其反應(yīng)曲線例：某病人的尿液AMY檢測結(jié)果為0U/L其反應(yīng)曲線如下圖：.*目前四十八頁\總數(shù)五十九頁\編于八點AMY反應(yīng)曲線.*目前四十九頁\總數(shù)五十九頁\編于八點AMY反應(yīng)曲線分析分析：由于測定物質(zhì)濃度過高處理：對測定物質(zhì)進行十倍左右的稀釋再測定，直到反應(yīng)曲線恢復(fù)正常結(jié)果才可靠.*目前五十頁\總數(shù)五十九頁\編于八點AMY反應(yīng)曲線.*目前五十一頁\總數(shù)五十九頁\編于八點AMY反應(yīng)曲線第一次稀釋后.*目前五十二頁\總數(shù)五十九頁\編于八點檢測項目的方法學(xué)

分析：CK是由M和B兩類亞基組成的二聚體，其構(gòu)成為CK-MB(心型)約占0-3%、CK-MM(肌型)約占97-100%、CK-BB（腦型）約占0-1%

.*目前五十三頁\總數(shù)五十九頁\編于八點影響檢驗結(jié)果的因素檢測項目的方法學(xué)：要了解該項目試劑采用的方法學(xué)：例：某病人在測定心肌酶譜時，其CK:246U/L、CK-MB:286U/L，標本無溶血等因素影響,其結(jié)果中CK-MB﹥CK.*目前五十四頁\總數(shù)五十九頁\編于八點CK-MB采用的檢測方法為免疫抑制法正常人體中，CK同工酶中CK-MM﹥CK-MB﹥CK-BB,其中CK-BB含量極少，可忽略。免疫抑制法正是建立于忽略CK-BB的基礎(chǔ)上。采用抗體抑制其M亞基活性，使CK-MM失去活性，而CK-MB失去一半的活性。單測定B亞基的活性，其結(jié)果×2即為CK-MB活性。由于在患輕度或中度腦損傷、腦血管意外及腦手術(shù)后造成腦組織發(fā)生實質(zhì)性損害的病人中，CK-BB會升高，這時該方法測定的CK-MB的活性相當于是CK-M