首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)報(bào)告

首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓名胡瑱霞劉暢學(xué)號(hào)112080000111120800017成績(jī)課程名稱(chēng)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)間星期三（上/下）上午實(shí)驗(yàn)題目離心技術(shù)與葉綠體和細(xì)胞核的密度梯度分離【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.以分離細(xì)胞核和葉綠體為例，掌握離心機(jī)的操作要點(diǎn)。2.了解兩種不同的離心方法。3.通過(guò)光鏡鑒定并分離細(xì)胞核和葉綠體?！緦?shí)驗(yàn)原理】用研缽研磨植物葉片可以使組織細(xì)胞在機(jī)械力的作用下破碎。而細(xì)胞器由于體積較小短時(shí)間研磨下幾乎不會(huì)被破壞。離心技術(shù)是根據(jù)顆粒在受到外向的離心力后而沉淀一種分離技術(shù)?？捎糜诩?xì)胞器的分離,分離的過(guò)程包括兩個(gè)主要階段:破碎細(xì)胞和細(xì)胞成分的分離。常用離心技術(shù)一般包括差速離心法和密度梯度離心。兩者的方法區(qū)別，應(yīng)用范圍等見(jiàn)下表。差速離心法密度梯度離心方法原理細(xì)胞中不同細(xì)胞器，大分子等的沉降系數(shù)不同（也有部分細(xì)胞器沉降系數(shù)之間有重疊部分）。逐漸增加離心速度低、高速交替進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)不同的顆粒在不同的分離速度及的離心時(shí)間下分批分離。當(dāng)不同顆粒存在浮力密度差時(shí)，在密度梯度介質(zhì)中，顆粒經(jīng)過(guò)足夠大離心力和足夠大時(shí)間后沉降或漂浮到與自身密度恰好相等的位置，并停留在這里達(dá)到平衡，形成一系列密度區(qū)，從而將不同浮力密度的物質(zhì)得到分離。應(yīng)用范圍常用于從組織勻漿中分離各種細(xì)胞器。一般應(yīng)用于分離大小相近，而密度差異較大的細(xì)胞或細(xì)胞器。例細(xì)胞器的初步分離分離提取核酸、亞細(xì)胞器和質(zhì)粒。3.在本次試驗(yàn)中，差速離心法采用了角度轉(zhuǎn)頭，而密度梯度離心則采用了水平磚頭?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果&分析】差速離心法（1）現(xiàn)象：離心后，離心管底部有深綠色沉淀（沉淀比較緊密地貼在離心管最底部的壁上），上清呈現(xiàn)較為澄清的淺綠色。（2）分析：RCF=(mωRCF=(mω2r)/(mg)=1.119×10-5n2rr-離心轉(zhuǎn)子的半徑距離，離心管的重心至轉(zhuǎn)軸中心間的距離，單位：cmg-地球重力加速度（980cm/sec2）n-轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（rpm）本次實(shí)驗(yàn)過(guò)程中差速離心速度是5000rpm，角度轉(zhuǎn)子的直徑大約在10cm左右。故根據(jù)以上RCF與rpm轉(zhuǎn)換公式可以計(jì)算得出，離心力約3000g左右。轉(zhuǎn)速×?xí)r間沉淀內(nèi)容物150g×25min完整細(xì)胞1000g×20min細(xì)胞核，細(xì)胞碎片3000g×6min葉綠體1000g×20min線粒體、溶酶體、微體105000×120min微粒體105000g×20min+0.26%脫氧膽酸鈉核糖體根據(jù)此表格可以得知：在此離心力下進(jìn)行差速離心5min，得到的沉淀中含有大量完整細(xì)胞、細(xì)胞核、細(xì)胞碎片和葉綠體等沉降系數(shù)較大的物質(zhì)。而上清中則含有較多的線粒體、溶酶體、微體、微粒體、核糖體等沉降系數(shù)較小的細(xì)胞器（也可能含有少量葉綠體、細(xì)胞核等）。這樣就使得葉綠體及細(xì)胞核和細(xì)胞中其余細(xì)胞器分離開(kāi)來(lái)。2.密度梯度離心（1）現(xiàn)象：（2）結(jié)果：離心后離心管中的植物組織樣品在顏色上出現(xiàn)分層。從上到下一共分為四層。上層液體較為澄清透明，綠色較淺。第二層顏色較深，為深綠色。第三層溶液顏色較第二層淺。最底層呈現(xiàn)深綠色，顏色最深。（3）分析：細(xì)胞核、葉綠體、細(xì)胞及細(xì)胞碎片的浮力密度不同，故可采用密度梯度離心法進(jìn)行分離。由于細(xì)胞碎片及細(xì)胞的浮力密度較大故大部分沉在最底層；細(xì)胞核的浮力密度較葉綠體大，所以細(xì)胞核大多存在于第三層層而葉綠體大多存在于第二層；溶解沉淀的CSK緩沖液不參與蔗糖梯度的形成，所以位于第一層。鏡檢（1）現(xiàn)象：第二層：大量葉綠體，個(gè)別細(xì)胞核第三層：較多細(xì)胞核和葉綠體第二層：大量葉綠體，個(gè)別細(xì)胞核第三層：較多細(xì)胞核和葉綠體第四層：大量細(xì)胞組織殘片，少量葉綠體第四層：大量細(xì)胞組織殘片，少量葉綠體（2）結(jié)果：分別用移液槍吸取各分層中的液體制片進(jìn)行鏡檢，發(fā)現(xiàn)從上到下第一層所取樣品中幾乎不含任何細(xì)胞器；第二層的樣品進(jìn)行鏡檢時(shí)可觀察到大量的葉綠體，改良苯酚品后染色后，可以看到個(gè)別細(xì)胞核；第三層的樣品取樣后鏡檢可看見(jiàn)較多的葉綠體，加改良苯酚品紅染色后可以觀察到較多的細(xì)胞核；第四層樣品鏡檢后看到少量葉綠體和大量細(xì)胞組織殘片。（3）分析：第1層中的溶液其實(shí)是用來(lái)溶解差速離心后沉淀的CSK緩沖液，里面雖然不溶解大量葉綠體，但可能含有研磨的過(guò)程中將部分葉綠體被研磨破碎后產(chǎn)生的色素分子，所以呈現(xiàn)澄清的淡綠色。密度梯度離心主要是根據(jù)細(xì)胞器生物大分子的浮力密度不同而對(duì)其進(jìn)行分離。細(xì)胞核的密度較葉綠體大故細(xì)胞核大多存在于倒數(shù)第二層而葉綠體大多居于倒數(shù)第三層。但實(shí)際鏡檢后發(fā)現(xiàn)，其實(shí)第三層中也含有較多葉綠體，第四層中也有較少的葉綠體，這可能是由于以下原因造成的：①我們上午組在密度梯度離心的過(guò)程中一共出現(xiàn)了兩次問(wèn)題：由于一組同學(xué)沒(méi)有蓋緊離心管蓋，離心時(shí)其崩開(kāi)，還有兩組同學(xué)沒(méi)有進(jìn)行很好的配平，離心機(jī)都是在加速到離心力=1000g時(shí)減速至停止。這樣一來(lái)就導(dǎo)致葉綠體在反復(fù)加速的過(guò)程中從原本的位置向下移動(dòng)，這就是為什么在各個(gè)分層中均有看見(jiàn)許多葉綠體的原因。②在制作完蔗糖梯度層，加入CSK緩沖液所溶解的沉淀過(guò)程中，不小心使力過(guò)大，打破了一部分界面，這樣可能導(dǎo)致離心后，不同濃度梯度層中都出現(xiàn)了與葉綠體自身密度相等的部分，所以葉綠體經(jīng)過(guò)離心后就停留在了不同層之中。細(xì)胞核，葉綠體、細(xì)胞碎片和完整細(xì)胞四者中，細(xì)胞碎片和完整細(xì)胞的浮力密度較大，主要存在于最下層，故在這層鏡檢時(shí)可看到許多細(xì)胞殘?jiān)?，另外最底層也含有少量的葉綠體，原因正如上面分析的那樣?！緦?shí)驗(yàn)反思】1.在剛密度梯度離心過(guò)后會(huì)發(fā)現(xiàn)其實(shí)是出現(xiàn)了5個(gè)條帶，但由于顆粒在2個(gè)不同濃度梯度中的擴(kuò)散是不可避免的，導(dǎo)致一個(gè)條帶很快消失了，沒(méi)有拍到照片也沒(méi)法進(jìn)行下一步的鏡檢等實(shí)驗(yàn)。因此我們猜想采用低溫的蔗糖溶液，percoll溶液制備蔗糖梯度會(huì)能使這條帶保留時(shí)間長(zhǎng)一些——因?yàn)榈蜏貤l件下由于溶液的黏度增加,擴(kuò)散也會(huì)變慢。2.本次實(shí)驗(yàn)由于密度梯度離心中的兩次離心機(jī)停止以及制作蔗糖梯度時(shí)破壞了濃度梯度層對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成了很大的影響，因此在以后，我們會(huì)多多注意這些小細(xì)節(jié)，不讓這些小失誤影響我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確度?！舅伎碱}】本實(shí)驗(yàn)采用了哪兩種離心技術(shù)？它們?cè)诜蛛x上有何不同？答：實(shí)驗(yàn)采用了差速離心和密度梯度離心這兩種離心技術(shù)。其主要區(qū)別在于差速離心的依據(jù)的是被離心物質(zhì)的沉降系數(shù)不同。逐漸增加離心速度低、高速交替進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)不同的顆粒在不同的分離速度及不同的離心時(shí)間下分批分離。常用于從組織勻漿中分離各種細(xì)胞器。而梯度密度