細胞生物學(xué)（王金發(fā)版）第二章細胞生物學(xué)研究方法

第二章細胞生物學(xué)研究方法細胞生物學(xué)以細胞為研究對象，從細胞的整體水平、亞顯微水平、分子水平三個層次，以動態(tài)的觀點研究細胞和細胞器結(jié)構(gòu)和功能、細胞生活史和各種生命活動。1．細胞結(jié)構(gòu)、成分的觀察-顯微成像技術(shù)原理：照明系統(tǒng)發(fā)出的光線或電子束通過樣品時，與樣品發(fā)生相互作用，其被改變的物理特征被肉眼觀察或通過探測器檢測而成像。分辨率：r=0.61λ/nsinα；分辨極限：一定波長的射線不能用以探測比它本身波長短得多的結(jié)構(gòu)細節(jié)。1.1普通光學(xué)顯微鏡及樣品制備1.1.1各種光學(xué)顯微鏡普通光學(xué)顯微鏡熒光顯微鏡：利用紫外線為光源照射樣品，使之發(fā)生熒光。相差顯微鏡：將不同成分的衍射系數(shù)改變?yōu)槊靼底兓０狄曇帮@微鏡：利用散射或衍射光增大反差。倒置顯微鏡：普通光學(xué)顯微鏡的倒置。1.1.2樣品制備取材、固定（殺死細胞，穩(wěn)定細胞的成分，形成一定硬度）、包埋、切片、染色、觀察。放射性自顯影：放射性同位素標記、底片。1.2電子顯微鏡及其樣品制備1.2.1電子顯微鏡透射電子顯微鏡照明系統(tǒng)為電子束，電磁透鏡調(diào)整電子束的亮度與聚焦，真空系統(tǒng)保護電子槍等。掃描電子顯微鏡極狹窄電子束掃描樣品，利用樣品表面形成的二次電子信號成像。掃描透射電子顯微鏡透射電子顯微鏡與掃描電子顯微鏡的結(jié)合：電子束掃描，透射電子成像。1.2.2樣品制備步驟：取材、固定、包埋、切片（超薄切片）、染色（負染色等）、觀察（放在載網(wǎng)上）。負染色：利用重金屬鹽對樣品進行染色，電子密度高的重金屬鹽包埋了樣品中低電子密度的背景，增強了背景散射電子的能力以提高反差。噴鍍技術(shù)：以一定角度在樣品的表面鍍上一層金屬，增強背景和待觀察樣品反差的方法。冷凍斷裂復(fù)型和冷凍蝕刻：生物樣品在液氮中迅速冷凍，然后迅速放入冷凍裝置中，并迅速抽成真空，用冰刀切割，然后觀察切口表面；或?qū)⑵錅囟壬晕⑸?，使樣品中的冰升華，會在表面浮雕出細胞膜的超微結(jié)構(gòu)。1.3間接成像技術(shù)掃描隧道顯微鏡：利用量子力學(xué)的隧道效應(yīng)，探針尖端與樣品表面可產(chǎn)生隧道電流，其值與距離呈指數(shù)變化關(guān)系。原子力顯微鏡：掃描隧道顯微鏡修改，利用探針原子與樣品表面的原子力的變化。X射線衍射技術(shù)：在原子分辨的水平上推測分子的結(jié)構(gòu)。2．細胞成分的組成、分布-細胞化學(xué)技術(shù)2.1酶細胞化學(xué)技術(shù)初級反應(yīng)：細胞內(nèi)酶作用于底物產(chǎn)生初級反應(yīng)產(chǎn)物。捕捉反應(yīng)：初級反應(yīng)產(chǎn)物與捕捉劑相互作用，產(chǎn)生顯微鏡下可見的最終反應(yīng)產(chǎn)物。2.2免疫細胞化學(xué)技術(shù)利用免疫反應(yīng)定位組織或細胞中的抗原成分分布。包括免疫熒光技術(shù)和免疫電鏡技術(shù)。2.3其它顯微分光光度術(shù)、顯微熒光光度術(shù)用來對相關(guān)成分進行定性、定量、分布的觀察。核磁共振技術(shù)分析有機化合物結(jié)構(gòu)。3．細胞及成分的分離-細胞分選技術(shù)、分離技術(shù)3.1細胞分選技術(shù)流式細胞儀：流室，激光光源，訊號檢測器，訊號分析部件，無細胞液滴收集器。細胞分選過程：細胞液經(jīng)流室形成單細胞懸液，激光檢測帶有熒光標記的細胞，信號檢測分析使液滴充電，經(jīng)電場分選進入無細胞液滴收集器。3.2分離技術(shù)3.2.1離心分離技術(shù)（1）速度離心分離細胞器和大分子在一定的離心速度下，不同大小的細胞器由于體積的不同，沉降速度也就不同，體積大的沉降快。差速離心：采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的細胞器。移動區(qū)帶離心：利用蔗糖或甘油制備輕微的連續(xù)密度，較長時間的離心。建立密度梯度的原因使防止擴散，但任一組分的密度都大于連續(xù)密度的最大值。（2）等速度離心分離細胞器和大分子利用介質(zhì)產(chǎn)生一種密度梯度，覆蓋了待分離物質(zhì)的密度，通過離心使不同密度的顆粒停留在相應(yīng)的介質(zhì)密度區(qū)。介質(zhì)可以是蔗糖或甘油，其密度較小，適于分離細胞器等；或利用CsCl，能夠自發(fā)建立密度梯度，同時密度比較大，適合分離DNA,RNA等。3.2.2層析分離技術(shù)根據(jù)混合物中各組分在物理化學(xué)性質(zhì)等方面的差異在固定相與流動相間進行反復(fù)多次的分配而得以使各組分的移動速度產(chǎn)生差異而分離。（1）凝膠過濾層析根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和形狀進行分離純化。（2）親和層析根據(jù)生物分子中有些分子的特定結(jié)合特性分離純化成分。（3）離子交換層析根據(jù)蛋白質(zhì)在不同pH環(huán)境下具有不同的帶電特性，而與固定相的特定電荷相互作用而分離純化。4．細胞培養(yǎng)-細胞工程技術(shù)在體外模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，培養(yǎng)從機體取出的細胞。4.1培養(yǎng)條件注意三個環(huán)節(jié)：營養(yǎng)、生存環(huán)境、廢物的排除。4.2培養(yǎng)過程原代細胞培養(yǎng)產(chǎn)生細胞系，再經(jīng)傳代培養(yǎng)得到具有特殊性質(zhì)或標志的細胞株。4.3培養(yǎng)方法懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)。5．與其它學(xué)科結(jié)合的相關(guān)技術(shù)-單克隆抗體技術(shù)、顯微操作技術(shù)、分子生物學(xué)方法等5.1單克隆抗體技術(shù)B細胞與突變的骨髓腫瘤細胞發(fā)生細胞融合，產(chǎn)生既能產(chǎn)生單一抗體，又能不斷增殖的雜種細胞。5.2顯微操作術(shù)用于對細胞的解剖手術(shù)及微量注射的技術(shù)。5.3分子生物學(xué)方法5.3.1基因工程選擇目的基因構(gòu)建工程質(zhì)粒，導(dǎo)入載體中表達，產(chǎn)生產(chǎn)品或進行基因功能的分析。5.3.2P復(fù)制目的DNA片段。步驟：引物設(shè)計和合成、DNA模版的制備、PCR反應(yīng)、產(chǎn)物的分離和純化。5.3.3選擇性基因Knockout和轉(zhuǎn)基因鼠目的基因插入正選擇標記基因，末端插入負選擇標記，導(dǎo)入胚胎干細胞，進行基因重組，然后篩選出正確重