鹽鹵蟲生長和發(fā)育指標(biāo)在毒性檢測中的應(yīng)用

鹽鹵蟲生長和發(fā)育指標(biāo)在毒性檢測中的應(yīng)用

:以Cr6+、Hg2+、Pb2+和Zn2+為例董少杰，楊軍，鄭曉市，周文禮*(1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)系，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津300384)摘要：研究了Cr6+、Hg2+、Pb2+和Zn2+四種重金屬離子對鹽鹵蟲生長和發(fā)育的影響。結(jié)果表明：四種重金屬離子對鹵蟲生長和發(fā)育均可產(chǎn)生顯著或極顯著的影響，但不同離子或離子的不同濃度對鹵蟲生長和發(fā)育產(chǎn)生影響的時間不同。四種離子中，除了0.04mg/LCr6+試驗組在72h和9mg/LPb2+試驗組在24h分別對鹵蟲的生長和發(fā)育表現(xiàn)出了極顯著的抑制作用外，其它離子在試驗所設(shè)定的濃度內(nèi)均對鹵蟲的生長和發(fā)育有顯著的促進(jìn)作用。利用鹵蟲生長和發(fā)育指標(biāo)可以對濃度較低的重金屬離子的毒性進(jìn)行檢驗。關(guān)鍵詞：鹵蟲；毒性檢測；生長；發(fā)育ThegrowthanddevelopmentofArtemiasalineappliedintestingtoxicity

:AcaseofCi6+,Hg2+,Pb2+andZn2+DongShaojie,YangJun,ZhengXiaoshi,ZhouWenli*(1.DepartmentofFisheryScience,TianjinAgriculturalCollege,KeyLaboratoryofAqua-ecologyandAquacultureofTianjin,

Tianjin300384,China)Abstract:EffectsofHg2+,Cr6+,Zn2+andPb2+ontheconditionofArtemiasalinegrowthanddevelopmentwerestudied.Theresultsshowedthateffectsof4kindsofheavymetalionsontheconditionofA.salinegrowthanddevelopmentwereremarkable(P<0.05)orhigh-remarkable(P<0.01)butactiontimeweredifference.All4kindsofionsobviouslypromotedtheconditionofA.salinegrowthanddevelopmentinsetconcentrationsexceptthat0.04mg/LCr6+groupofferedinhibitionofA.salinegrowthatseventy-secondhourand9mg/LPb2+groupofferedinhibitionofA.salinedevelopmentattwenty-fourthhour.TheconditionofA.salinegrowthanddevelopmentcouldbeusedtotesttoxicityoflowconcentrationheavymetalions.Keywords:ArtemiaSalina;ToxicityTesting;Growth;Development鹵蟲無節(jié)幼體為無選擇性的濾食性生物，其呼吸器官位于胸肢的外葉上，無鰓蓋覆蓋直接裸露，生活習(xí)性和生理結(jié)構(gòu)決定其易受毒物攻擊，常被用于環(huán)境污染物的毒性評價和生態(tài)毒理學(xué)的研究，已被《海洋石油勘探開發(fā)污染物的生物毒性檢驗方法》(GB18420.2-2001)列為標(biāo)準(zhǔn)試驗生物［1-2］試驗生物的死亡率是生物毒性試驗方法中常用的觀測指標(biāo)，但在污染物濃度較低的情況下具有一定的局限性。海水環(huán)境中痕量及微量重金屬元素是影響生物生長和發(fā)育的因素之一。各種金屬元素在生物體內(nèi)都有一定的限量，在生理濃度范圍內(nèi)的金屬離子可加速生物體的新陳代謝，促進(jìn)其基金項目：山東省博士后創(chuàng)新基金(200802040)；天津農(nóng)學(xué)院科學(xué)發(fā)展基金(2009D05)通訊作者簡介：生殖、生長，但稍微過量則會對生物產(chǎn)生毒性效應(yīng)［3］。本試驗通過研究四種重金屬離子對鹽鹵蟲"miasaline）生長和發(fā)育的影響，探討運用試驗生物的生長和發(fā)育指標(biāo)檢測污染物毒性的可行性，以期為海洋污染物的生物毒性評價提供更多可行的觀測指標(biāo)。1材料與方法1.1試驗材料鹽鹵蟲休眠卵，以下簡稱鹵蟲卵，為商品卵。毒性試驗前24h孵化鹵蟲卵，選取24h之內(nèi)孵化的鹵蟲作為試驗材料。試驗用海水由蒸餾水和海水晶配置而成，鹽度30%。，用NaHCO3和0.lmol/L的HCI調(diào)節(jié)pH至8.0±0.5。將KCrO、HgCl、Pb（NO3）,和ZnSO用純水配成儲備液，使用時用海水稀釋至適當(dāng)?shù)呢?匕/ 匕 匕濃度。1.2試驗方法各離子均設(shè)置9個不同濃度的試驗組和1個空白組，每個試驗組設(shè)置3個平行組，各平行組中均加入100只鹵蟲，試驗液體積250mL。鹵蟲在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度28^，鹽度30%。。用鹽度及重金屬離子濃度與試驗組相同的海水配置酵母溶液，分別于培養(yǎng)48h和72h后投喂1次。試驗期間不換水。1.3試驗觀察分別于24h，48h，72h及96h后取樣，自每個平行組中取10只鹵蟲，酒精固定。顯微鏡觀測每只鹵蟲的體長，并參照廖承義的方法囹，觀察每只鹵蟲的發(fā)育齡期，記錄平均值。1.4數(shù)據(jù)處理與分析使用SPSS17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用單因素方差分析和Dunnett檢驗對體長數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析和多重比較，對發(fā)育齡期數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗，P<0.05被認(rèn)為是差異顯著，P<0.01被認(rèn)為是差異極顯著。與對照組無顯著性差異的最高濃度被視為無可見影響濃度（No-observedeffectconcentration，NOEC）⑸。2結(jié)果與分析Cr6+對鹵蟲生長和發(fā)育的影響Cr6+對鹵蟲生長的影響Cr6+對鹵蟲生長的影響見表1。單因素方差分析結(jié)果表明，不同濃度的Cr6+在24h、48h、72h和96h內(nèi)對鹵蟲的生長均有極顯著的影響（P<0.01）。多重比較結(jié)果表明，Cr6+對鹵蟲體長在24h、48h、72h和96h的NOEC值分別為>0.28mg/L、0.2mg/L、<0.04mg/L和0.24mg/L，24h~72h期間NOEC值逐漸降低，至96h后NOEC值升高至0.24mg/L。48h時0.24mg/L試驗組鹵蟲體長顯著長于對照組（P<0.05），96h時0.28mg/L試驗組鹵蟲體長極顯著長于對照組（P<0.01），而72h時0.04mg/L試驗組鹵蟲體長極顯著小于對照組（P<0.01）。

表1 C”+對鹵蟲生長的影響（mm）試驗分組/mg.L-1體長24h48h72h96h對照組2.8733+0.06193.6733+0.07164.3200+0.06924.4172+0.07860.042.9033+0.07653.6567+0.09543.8600+0.1123**4.3733+0.12080.082.8867+0.08383.7100+0.10084.2000+0.11724.5933+0.08290.122.7867+0.09113.8267+0.07474.2133+0.12054.4700+0.10160.162.7233+0.09323.8067+0.06624.0800+0.07864.5567+0.08030.22.6100+0.05683.4900+0.07844.1267+0.06214.4300+0.08070.242.9367+0.06004.0200+0.0837*4.1133+0.10814.2967+0.08090.282.9233+0.06503.9667+0.07904.5200+0.09455.1733+0.0758**注“*”表示與對照組差異顯著（p<0.05）,“**”表示與對照組差異極顯著（p<0.01）。以下各表相同。2.3.2Cr6+對鹵蟲發(fā)育的影響Cr6+對鹵蟲發(fā)育的影響結(jié)果見表2。卡方分析結(jié)果表明，Cr6+在48h和96h對鹵蟲發(fā)育有極顯著的影響（尸<0.01）。對48h和96h各組鹵蟲發(fā)育情況與對照組進(jìn)行卡方檢驗，結(jié)果表明，Cr6+對鹵蟲發(fā)育在24h,72h的NOEC值均為>0.28mg/L。48h和96h的NOEC值均為0.12mg/L,試驗組在48h時處于四齡期的比例高于對照組，在96h時處于五齡期的比例高于對照組。表2 Ce對鹵蟲發(fā)育的影響處于不同齡期鹵蟲個體的比例試驗分組/mg.L-124h48h72h96h對照組0:19:11:0:00:0:21:9:00:0:4:26:00:0:3:19:110.041:12:17:0:00:0:16:11:00:3:8:19:00:1:3:20:60.080:14:16:0:00:0:17:11:00:1:7:22:00:0:2:18:100.122:12:16:0:00:0:13:16:00:1:6:24:00:1:1:15:130.163:15:12:0:00:0:10:18:0*0:0:8:22:00:0:4:6:20**0.20:24:6:0:00:0:21:8:00:0:8:22:00:1:1:18:100.240:16:14:0:00:0:8:22:0**0:1:12:17:00:0:3:13:140.280:13:17:0:00:0:10:20:0*0:0:3:27:00:0:0:0:30*注：表中數(shù)據(jù)代表處于不同齡期的鹵蟲比例，由左向右依次為一齡至五齡。以下各表相同。2.2Hg2+對鹵蟲生長和發(fā)育的影響2.2.1Hg2+對鹵蟲生長的影響Hg2+對鹵蟲生長的影響見表3。單因素方差分析結(jié)果表明，不同濃度的Hg2+對24h、48h、72h和96h鹵蟲的生長均有顯著或極顯著的影響。多重比較結(jié)果表明，Hg2+對鹵蟲生長在24h的NOEC值為<0.5mg/L，0.5mg/L試驗組鹵蟲體長顯著長于對照組（P<0.05）。在48h、72h

和96h的NOEC值均為1.0mg/L,1.5mg/L試驗組鹵蟲體長在48h和96h時，極顯著長于對照組（P<0.01），在72h時顯著長于對照組（尸<0.05）。 表3 Hg2+對鹵蟲生長的影響（mm）試驗分組/mg.L-1體長24h48h72h96h對照組2.3333+0.07972.9833+0.05573.3333+0.05153.4433+0.05610.52.5900+0.0543*3.1667+0.07623.2500+0.06733.4433+0.067212.4300+0.06143.2333+0.06843.4800+0.08733.6333+0.06751.52.4367+0.04853.4333+0.0835**3.5933+0.0848*3.7500+0.0693**22.4467+0.06763.1733+0.06933.3833+0.05933.6500+0.05402.52.5500+0.06323.3400+0.0891**3.5533+0.06063.5267+0.07242.2.2Hg2+對鹵蟲發(fā)育的影響Hg2+對鹵蟲發(fā)育的影響見表4?？ǚ綑z驗表明，Hg2+僅對各組鹵蟲48h生長的影響極顯著（P<0.01）。對48h各組鹵蟲發(fā)育情況與對照組進(jìn)行卡方檢驗，Hg2+對鹵蟲發(fā)育在48h的NOEC值為<0.5mg/L，其中試驗組在藥物濃度為0.5mg/L?2.5mg/L的范圍內(nèi)，處于三齡期的個體均極顯著高于對照組（P<0.01）。在24h、72h和96h的NOEC值均為>2.5mg/L。表4 Hg2+對鹵蟲發(fā)育的影響處于不同齡期鹵蟲個體的比例試驗分組/mg.L-124h48h72h96h對照組9:21:0:0:00:21:9:0:00:2:28:0:00:19:11:0:00.51:26:3:0:00:11:19:0:0*0:5:25:0:01:12:17:0:014:25:1:0:00:4:26:0:0**0:4:23:3:00:14:16:0:01.53:26:1:0:00:4:24:2:0**0:1:26:3:02:12:16:0:026:23:1:0:00:7:22:1:0**0:3:27:0:03:15:12:0:02.53:26:1:0:00:3:25:3:0**0:1:26:3:00:24:6:0:02.3Pb2+對鹵蟲生長和發(fā)育的影響2.3.1Pb2+對鹵蟲生長的影響Pb2+對鹵蟲生長的影響見表5。單因素方差分析結(jié)果表明，不同濃度的Pb2+在24h、48h、72h和96h內(nèi)對鹵蟲的生長均有極顯著的影響（P<0.01）。多重比較結(jié)果表明，Pb2+對鹵蟲體長在24h、48h、72h和96h的NOEC值依次降低，分別為6mg/L、3mg/L和<3mg/L。24h時9mg/L試驗組和48h時6mg/L試驗組鹵蟲體長均顯著高于對照組（P<0.05），72h和96h時3mg/L試驗組鹵蟲體長均極顯著的高于對照組（P<0.01）。

表5 Pb2+對鹵蟲生長的影響（mm）試驗分組/mg.L-1體長24h48h72h96h對照組2.6067+0.07163.3500+0.09273.5800+0.07593.6367+0.102332.7633+0.06873.5733+0.04703.9567+0.0844**4.0333+0.0945**62.7300+0.05393.6300+0.0746*3.9667+0.0631**3.8800+0.086592.8300+0.0624*3.7067+0.06483.8267+0.10533.7367+0.0686123.1233+0.0486**3.5600+0.06443.9167+0.0642**3.8400+0.0826152.9000+0.0547**3.4067+0.07603.7667+0.05103.5567+0.7122182.9033+0.0568**3.4500+0.07763.6667+0.06803.6100+0.06742.3.2 Pb2+對鹵蟲發(fā)育的影響Pb2+對鹵蟲蟲發(fā)育的影響見表6。卡方檢驗表明，Pb2+對24h和72h鹵蟲的發(fā)育有極顯著的影響（P<0.01）。對24h和72h各組鹵蟲發(fā)育情況與對照組進(jìn)行卡方檢驗表明，Pb2+對鹵蟲發(fā)育在24h和72h的NOEC值分別為6mg/L和15mg/L，在48h和96h的NOEC值均為<3mg/L。24h時9mg/L試驗組三齡期鹵蟲比例極顯著高于對照組（P<0.01），而72h時18mg/L試驗組四齡期鹵蟲比例極顯著低于對照組（P<0.01）。表6 Pb2+對鹵蟲發(fā)育的影響試驗分組/mg.L-1處于不同齡期鹵蟲個體的比例24h48h72h96h對照組4:24:2:0:00:6:21:3:00:1:11:18:00:0:17:10:131:22:7:0:00:1:23:6:00:0:15:15:00:0:15:9:660:25:5:0:00:3:20:7:00:0:17:13:00:0:17:10:390:21:9:0:0*0:1:23:6:00:2:11:17:00:0:23:7:0120:11:19:0:0*0:2:24:3:00:0:20:10:00:0:17:11:2150:22:8:0:00:6:22:1:00:0:19:11:00:0:24:6:0180:22:8:0:0*0:3:25:3:00:1:25:5:0*0:0:24:5:12.4Zn2+對鹵蟲生長和發(fā)育的影響2.4.1Zn2+對鹵蟲生長的影響Zn2+對鹵蟲生長的影響見表7。單因素方差分析結(jié)果表明，不同濃度的Pb2+在24h和72h內(nèi)對鹵蟲的生長均有極顯著的影響（P<0.01）。多重比較結(jié)果表明，Zn2+對鹵蟲體長在24h的NOEC值為<0.04mg/L，在72h的NOEC值為0.04mg/L，在48h和96h的NOEC值均為>0.28mg/L。24h和72h0.04mg/L試驗組鹵蟲的體長顯著長于對照組（P<0.05）。

表7 Zn2+對鹵蟲生長的影響（mm）試驗分組/mg.L-1體長24h48h72h96h對照組2.6500+0.06303.3400+0.04763.5700+0.05173.8367+0.05780.042.8933+0.0470*3.3767+0.04883.6033+0.06353.8567+0.04950.082.8933+0.0452*3.3933+0.04883.7633+0.0517*3.9333+0.07810.122.7733+0.05573.2933+0.03743.5667+0.05373.6667+0.05040.162.7167+0.07323.3533+0.05503.5600+0.04763.7033+0.04660.22.8567+0.0513*3.4200+0.03343.5833+0.04263.7133+0.04230.242.9633+0.0511**3.4500+0.04233.5467+0.04953.8400+0.05220.283.0400+0.0364**3.4433+0.04543.5433+0.04983.7633+0.04922.4.2Zn2對鹵蟲發(fā)育的影響Zn2+對鹵蟲蟲發(fā)育的影響見表8?？ǚ綑z驗表明，Zn2+對24h和96h鹵蟲的發(fā)育分別有極顯著3＜0.01）和顯著的影響（尸＜0.05）。對24h和96h各組鹵蟲發(fā)育情況與對照組進(jìn)行卡方檢驗表明，Zn2+對鹵蟲發(fā)育在24h和96h的NOEC值均為＜0.04mg/L，在48h和72h的NOEC值均為＞0.28mg/L。0.04mg/L試驗組在24h時處于三齡期鹵蟲的比例顯著高于對照組3＜0.05），在96h時處于五齡期鹵蟲的比例顯著高于對照組（尸＜0.05）。表8 Zn2+對鹵蟲發(fā)育的影響處于不同齡期鹵蟲個體的比例試驗分組/mg.L-124h48h72h96h對照組0:26:4:0:00:4:25:1:00:0:26:4:00:0:20:10:00.040:18:12:0:00:3:24:3:00:0:26:4:00:0:19:10:1*0.080:17:13:0:0*0:2:25:3:00:0:24:6:00:0:19:6:50.120:16:14:0:0*0:5:25:0:00:0:27:3:00:0:26:5:00.160:15:15:0:0*0:7:22:1:00:0:28:2:00:0:26:4:00.20:11:19:0:0*0:1:29:0:00:1:28:1:00:0:26:5:00.240:8:22:0:0**0:4:26:0:00:0:29:1:00:0:21:9:10.280:7:23:0:0**0:3:27:0:00:0:28:2:00:0:24:6:03討論3.1四種重金屬離子對鹵蟲生長的影響試驗結(jié)果表明，Cr6+、Hg2+、Pb2+和Zn2+四種重金屬離子對鹵蟲的生長均可產(chǎn)生極顯著的影響。四種離子中僅0.04mg/LCr6+試驗組在72h抑制了鹵蟲生長，其在48h和96h以及其它離子均極顯著的促進(jìn)了鹵蟲生長。Sarabias等人研究了鹵蟲在Hg2+濃度為25州時的生長狀況，發(fā)現(xiàn)0-250h試驗期間內(nèi)，毒物組鹵蟲體長均高于對照組，與本試驗結(jié)果基本吻合。Sarabias等人將此現(xiàn)象稱為毒物興奮效應(yīng)，即生物在遇到不利環(huán)境因素的干擾時，可能會以快速發(fā)育和增加繁殖量的方式來應(yīng)對不良環(huán)境的刺激。試驗結(jié)果同時表明，四種重金屬離子對鹵蟲生長的影響階段不同，且有的離子在不同階段的NOEC值也不同。Cr6+對24h?72h期間對鹵蟲生長的NOEC值逐漸降低，96h后NOEC值升高。Hg2+對鹵蟲生長的NOEC值在48h、72h和96h均為1.0mg/L，表現(xiàn)出一定的穩(wěn)定性。Pb2+對鹵蟲體長在24h、48h、72h和96h的NOEC值則依次降低。Zn2+在24h、48h、72h和96h期間對鹵蟲生長的NOEC值出現(xiàn)鋸齒狀波動。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是鹵蟲在不同發(fā)育階段對于不同離子的生理濃度范圍不同所致。具體原因還有待研究。3.2四種重金屬離子對鹵蟲發(fā)育的影響Cr6+、Hg2+、Pb2+和Zn2+四種重金屬離子對鹵蟲的發(fā)育均可產(chǎn)生顯著或極顯著的影響。僅18mg/LPb2+試驗組在72h對鹵蟲的發(fā)育表現(xiàn)出了極顯著的抑制作用，9mg/LPb2+試驗組在24h及其它離子均對鹵蟲的發(fā)育表現(xiàn)出顯著或極顯著的促進(jìn)作用。這與此四種重金屬離子對鹵蟲生長所產(chǎn)生的影響基本相符。除了日&2+在24h、72h和96h對鹵蟲發(fā)育的NOEC值較為一致外，其它離子對鹵蟲發(fā)育的NOEC值在24h、48h、72h和96h期間均呈現(xiàn)出鋸齒狀波動。這與四種重金屬離子對鹵蟲生長所產(chǎn)生的影響不同。3.3鹵蟲生長和發(fā)育指標(biāo)在污染物毒性檢測中的應(yīng)用目前在毒性檢測方法中多以鹵蟲的存活率為觀測指標(biāo)，對其生長及發(fā)育情況的應(yīng)用不如水蚤廣泛。受試生物的生長和發(fā)育情況作為觀測指標(biāo)時，多以體重指標(biāo)來反映受試生物的生長情況。對于鹵蟲、水蚤這些個體較小的生物，測量體重不僅需要較多的生物個體，而且對儀器和稱量環(huán)境有較高的要求，還會增加試驗規(guī)模，試驗操作繁瑣也容易產(chǎn)生誤差。相比之下，測量體長則簡便得多⑸。受試生物的生長和發(fā)育情況作為觀測指標(biāo)檢測污染物毒性時，試驗時長對于檢測效果可能會產(chǎn)生影響。Fichet[7]研究了釩離子對鹵蟲