基因工程新技術

基因工程新技術第一頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五1.λRed和RecET重組系統(tǒng)及其應用

2.位點特異性重組系統(tǒng)及其應用

3.基因打靶

4.基因抑制技術

第二頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五早在1990s,研究者發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母等真菌中具有高效的同源重組系統(tǒng)，僅需要20~40bp長的同源區(qū)即可發(fā)生重組。可以方便的利用PCR產(chǎn)物進行基因打靶或替換。細菌的同源重組頻率較低，且需要較長的同源區(qū)段.1.λRed和RecET重組系統(tǒng)及其應用E.coli

自身的同源重組系統(tǒng)主要包括：RecBCD,RecE,RecF系統(tǒng)，其重組效率均較低，且對同源區(qū)要求為：1–2kb。最主要的重組系統(tǒng)RecBCD在

dsDNA同源區(qū)為50–100kb(通過接合轉移和轉導)

，才能高效重組。經(jīng)修飾過的RecBCD及RecA系統(tǒng)能在Chi位點(crossoverhotspotinstigator,GCTGGTGG)高效重組，同源區(qū)段長度一般不低于5kb，重組需要DNA片段兩端有同向的CHI位點。如果人工構建這樣的片段，其重組幾率為10-5第三頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五1998年左右，隨著對λ噬菌體重組系統(tǒng)的深入研究，發(fā)現(xiàn)該重組系統(tǒng)可以在E.coli中實現(xiàn)高效同源重組，且同源區(qū)長度要求極低：約40bp。后來，在Rac噬菌體中發(fā)現(xiàn)類似的重組系統(tǒng)。隨著該技術的應用，出現(xiàn)了一個新的術語：Recombineering(recombination-mediatedgeneticengineering)isageneticandmolecularbiologytechniquebasedonhomologousrecombinationsystemsinE.coliandotherbacteriamediatedbyphageproteins,eitherRecE/TfromRacprophageorRedalpha/beta/gammafrombacteriophagelambda第四頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五λRed/ETrecombinationsystemsarehighlightedbytheirabilitytocrossPCR-generatedsubstratesbearingsmallregionsofhomologytothetargetgene(40–50bp)intobacterialchromosomes,allowingbacterialgeneticiststoperformPCR-mediatedgenereplacement第五頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五(1)λRed系統(tǒng)

及rac噬菌體的RecET系統(tǒng)的原理Red系統(tǒng)包括3個基因:exo,bet

和gamexo

基因編碼λ核酸外切酶，其活性形式是一種環(huán)狀三聚物分子,中間有一中空的通道,通道的一端可容納雙鏈DNA分子,另一端只可容納單鏈DNA。Exo蛋白可結合在雙鏈DNA的末端,從DNA雙鏈的5′端向3′端降解DNA,產(chǎn)生3′突出端。(RecE)Beta蛋白是一種退火蛋白,自發(fā)地形成環(huán)狀結構(12–18subunitsperring),,緊緊地結合在單鏈DNA3′突出端,防止DNA被單鏈核酸酶降解,同時介導互補單鏈DNA的退火,雙鏈DNA退火完成后,Beta蛋白從DNA雙鏈上解離下來。Beta蛋白在Red同源重組過程中起著決定性的作(RecT)

Gam蛋白可與RecBCD結合,抑制其核酸外切酶活性，防止對外源DNA的降解。宿主菌用recBCD缺陷株有利于該系統(tǒng)的高效重組。λRed系統(tǒng)的重組效率約比RecET系統(tǒng)高3倍。★第六頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五第七頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五(2)主要應用需要輔助質粒，上面帶有誘導表達的重組系統(tǒng)。為避免本底表達對細胞的影響（毒性、誘變等效應），輔助質粒多為溫敏性質粒，可在高溫下被消除。PCR產(chǎn)物擴增誘導培養(yǎng)含pKD46大腸桿菌轉化PCR片段，培養(yǎng)2h后涂布抗性平板，高溫培養(yǎng)I基因敲除及markerfree操作（需結合位點特異性重組技術）第八頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五II結合反向篩選進行基因替換正向篩選：含有標記基因的克隆在篩選平板上長出，不含標記基因則死亡。反向篩選：也稱為負篩選，含有標記基因的克隆死亡，不含標記基因的克隆正常生長catsacBgeneAgeneAMutantcatsacBcatsacBgeneAMutantStep1Step2例：cat正篩選標記，sacB負篩選標記chloramphenicolMediumsucrose重疊延伸PCR基因敲除第九頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五catsacBgeneAgeneAcatsacBcatsacBgeneAStep1Step2Geneinversion（smallfragment)第十頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五III介導單鏈DAN重組，進行基因修飾如果向細胞中導入ssDNA(DNAoligo),則不需要Exo蛋白就能夠與同源區(qū)退火，實際上，Bet單獨作用可以使70-basessDNAoligo(SSO)與染色體的同源區(qū)退火互補而發(fā)生重組，其頻率約2×105/108,比dsDNA略高。如果存在Gam蛋白，則重組效率可提高(5-fold）.40–60bp單鏈的重組效率下降5倍。另外，和滯后鏈重組的效率高于前導鏈。由于不能插入標記基因，使得其只能應用于具有明顯表型特征的基因修飾。

改進：

MMR(specifcallyremovetheoligo-directedbasechange)系統(tǒng)缺陷株中，重組效率會提高2個數(shù)量級，可高達25%！這意味著不再需要標記基因，可以進行數(shù)個堿基的替換、插入或缺失。mutS:Methyl-directedMismatchRepair第十一頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五重大改進：MAGE技術（MultiplexAutomatedGenomeEngineering）1.多種ssDNA并行重組，同時進行多位點修飾。2.多輪循環(huán)重組，提高多位點修飾的幾率3.適于高通量的隨機優(yōu)化缺點：對于多位點隨機優(yōu)化，需要高通量篩選技術，或具有明顯的表型特征只能進行短序列的修飾（如RBS位點）第十二頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五ProgrammingcellsbymultiplexgenomeengineeringandacceleratedevolutionNature

460,894-898第十三頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五markermarker2IV染色體大片段復制

復制染色體上的基因：加入PCR產(chǎn)物，引物設計時上游引物與目標基因下游序列同源，下游引物與目標基因上游序列同源，第一次重組造成染色體斷裂，第二次重組一條染色體修復，并造成目標基因多一個拷貝。

引物設計時加入同向排列的特異性位點，可彈出MARKER

應用該技術可復制長達1Mbp的序列。第十四頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五2.位點特異性重組系統(tǒng)及其應用位點特異性重組重組發(fā)生在特殊位點上，此位點含有短的同源序列,供重組蛋白識別。

位點特異性重組與同源重組的區(qū)別

重組位點限制：有同源序列的長短：短重組酶的專一性：有重組效率：高達100%常見的位點特異性重組系統(tǒng)

λ噬菌體系統(tǒng)：λ噬菌體編碼λ整合酶（integrase，Int重組酶，不可逆）、來自E.coli的整合作用宿主因子（IHF，integrationhostfactor）、切除酶（excisionase）

P1噬菌體系統(tǒng):Cre重組酶（可逆）

2m質粒系統(tǒng)：FLP重組酶（可逆）

鏈霉菌噬菌體C31系統(tǒng)（不可逆）均可廣泛應用于真核細胞中第十五頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五兩邊為13bp反向重復序列，中間位8bp非對稱核心序列第十六頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五（1）重組機理如果一個DNA分子上兩個特異位點之間發(fā)生重組，其后果有兩種可能性：兩個位點之間的片段或丟失，或被顛倒生物能夠利用這種重組倒置來控制基因的表達因為DNA的一正一倒兩種排列法可以相應地表達兩種不同的蛋白質，細胞就可根據(jù)需要作出選擇。Cre重組酶催化位點：loxP位點loxPloxPloxPloxP第十七頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五當基因組含有一個重組酶識別位點時，轉入基因可以發(fā)生位點特異性整合，但必須解決整合的穩(wěn)定性問題loxp位點的點突變Cre酶無法有效識別降低基因丟失幾率：突變點第十八頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五loxp位點的點突變Cre酶無法有效識別實現(xiàn)穩(wěn)定的基因顛倒：突變點或者采用類似于λred系統(tǒng)的策略，重組酶基因在溫敏性輔助質粒上誘導表達第十九頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五（2）主要應用

I利用位點特異性重組控制轉入基因的表達將一個序列置于目標基因與其啟動子之間（如轉錄終止單元＋loxP序列）阻遏基因的表達將cre基因置于誘導啟動子控制之下，控制Cre重組酶的表達，從而控制目標基因的表達loxPloxP第二十頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五II條件缺失突變體的構建在目標基因的兩側引入特異性重組位點將cre基因置于誘導啟動子或具有組織特異性的啟動子控制之下，在某種條件下使Cre重組酶表達，從而缺失目標基因優(yōu)點：同源重組造成“完全的”基因敲除，而同源重組和位點特異性重組結合后可以對基因敲除進行時間和空間上的控制，例如可以研究致死型基因在特殊發(fā)育階段的效應、研究基因是否在某種組織中表達。要避免Cre重組酶的背景活性第二十一頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五III利用位點特異性重組進行染色體工程markermarkermarker1marker2FRT/loxPFRT/loxPFRT/loxPFRT/loxPFRT/loxPFRT/loxP位點特異性重組大腸桿菌中采用該方式一次性刪除117-165-kbp片段，效率100%Markerfree操作，但不屬于無痕操作，每次重組留下一個疤痕，造成極性效應，多影響下游基因表達。多個疤痕對后續(xù)操作也有不利影響第二十二頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五例：植物中染色體大片段的缺失gusA：編碼β-葡(萄)糖苷酸酶，報告基因Ds:植物轉座子第二十三頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五

染色體大片段顛倒：兩個特異性位點反向排列，重組酶表達后，部分細胞的兩個位點之間序列顛倒。FRT/loxPFRT/loxPmarker1marker2marker1marker2基因融合tagsequenceloxP/FRTsequencegeneACterminalsequence(notranslationstopsignal)markergeneAmarkermolecularcloningfree第二十四頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五AsinglechromosomalFRTsitebecomesthesubstrateforrecombinationwithFRT-containingreplication-deficientplasmidsthatcarrieslacZandlacY,designedinsuchawaytocreateeitheratranscriptionalortranslationalfusiontothepromoterofinterest.第二十五頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五3.基因打靶及無痕操作技術基因打靶：利用外源DNA與染色體DNA的同源性進行同源重組，從而定點修飾改造染色體DNA的一類技術。（1）主要方法單交換同源重組雙交換同源重組二次單交換同源重組（屬于無痕操作技術）其它無痕操縱技術第二十六頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五I單交換同源重組法

利用整合性質粒上與染色體DNA同源的區(qū)段進行同源重組，通過整合性質粒插入染色體來達到對染色體DNA的復制、失活、啟動子替換等目的。原理圖：啟動子+完整orfA:復制orfA的5’端或中間區(qū)域：失活orfA的3‘端區(qū)域：對基因A表達無影響，在染色體上多了一個不完整的orfA拷貝（缺5’端）誘導啟動子+5‘端：實現(xiàn)A基因的啟動子替換、構建條件敲除株第二十七頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五構建整合質粒：原啟動子+orfA5’端與報告基因的融合片段（轉錄融合、翻譯融合均可）可以通過報告基因研究原啟動子的表達規(guī)律，即基因A的表達規(guī)律第二十八頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五對于高效短同源重組系統(tǒng)，可用兩端有短同源區(qū)的PCR產(chǎn)物直接進行基因打靶（見red系統(tǒng)），省去克隆步驟。對于長同源區(qū)重組系統(tǒng)，無法通過PCR引物引入同源區(qū)，需要經(jīng)過多次克隆構建基因打靶質粒，然后轉化質粒進行基因打靶II雙交換同源重組Marker2Marker2可實現(xiàn)基因敲除(B)及基因的異位整合表達(A)orfB第二十九頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五白喉毒素A基因（DTPA)的負篩選作用：A亞基抑制蛋白合成，不需加篩選藥物，從而避免真核細胞的非同源重組整合neo基因的正篩選作用，對氨基糖苷類抗生素G418的抗性單純皰疹病毒胸苷激酶

(HSVTK)基因的負篩選作用，將丙氧鳥苷或非阿尿苷（FIAU）變?yōu)槎拘晕镔|，在含丙氧鳥苷或FIAU培養(yǎng)基中篩選基因尋靶質粒Cre表達質粒突變基因動物基因打靶過程：P319圖14.1，若不需彈出篩選標記見圖14.2第三十頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五III二次單交換同源重組（屬于無痕操作技術）通過重疊延伸PCR技術連接片段A和C，缺失B片段（數(shù)十~數(shù)百個密碼子序列），得到的AC片段的編碼產(chǎn)物缺失了部分氨基酸。如果將該AC片段替代染色體上ABC片段，即可實現(xiàn)基因打靶，而且是無痕操作，沒有任何多余的核苷酸殘留的染色體上。第三十一頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五uppcatABCMCSblaACSinglecrossoverGrowthonMSMmediumcontaining20?M5FUCregionrecombinationAregionrecombinationABCACWildtypeMarkerlessBkonckoutStep3第三十二頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五也可利用二次單交換同源重組進行等位基因置換第三十三頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五第三十四頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五IV其它無痕操作技術Usingthismethod,Kolisnychenkoetal.deleted0.37MbofE.coliDNAconsistingofcrypticprophages,transposons,damagedgenesandgenesofunknownfunction.ThisstrainMDS12resultedina8.3%reductionofgenomecontentSceI+recA重組系統(tǒng)：設計PCR產(chǎn)物（含酶切位點red同源重組誘導SceI表達recA重組修復第三十五頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五4.基因抑制技術4.1核酸水平的基因抑制

（1）反義核酸技術（2）共抑制（3）RNA干涉（4）核酶構件

第三十六頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五（1）反義核酸技術正義鏈反義鏈反義技術：根據(jù)堿基互補原理，表達天然的或人工合成的與特定基因互補的反義核酸（RNA或DNA)片段，在胞內形成雙鏈體，從而對特定基因的表達進行抑制或封閉的技術。反義核酸是細胞中（主要在原核細胞中）天然存在的一種調節(jié)分子，可以調節(jié)基因的轉錄、mRNA剪切或修飾、蛋白質的翻譯過程。

4.1核酸水平的基因抑制5335+-第三十七頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五構建反義基因表達載體，轉化入反義基因，持續(xù)穩(wěn)定地抑制基因表達。或者直接將反義核酸片段導入細胞，對基因表達進行短期干擾。

根據(jù)作用方式不同可將反義核酸技術分為3類：①反義DNA技術：合成的反義寡脫氧核苷酸被攝入靶細胞并與靶mRNA結合，干擾mRNA的轉錄或阻斷蛋白翻譯；②反義RNA技術：將反義寡脫氧核苷酸序列連接到載體(病毒、質粒上)導入靶細胞，載入的寡核苷酸轉錄出反義RNA，與靶mRNA交聯(lián)，封閉mRNA蛋白翻譯過程；（最主要的一類）③核酶技術：核酶是一類具有酶特性的RNA分子，通過催化靶位點RNA鏈中磷酸二酯鍵的斷裂，特異性地剪切底物RNA分子，從而阻斷基因的表達第三十八頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五反義RNA的抑制效果與RNA二級結構有重要關系。在原核細胞中，反義RNA以針對SD序列效果最好，而在真核細胞中以5‘端非編碼區(qū)為標靶最有效。主要作用機理有以下幾種：①mRNA5’端非翻譯區(qū)，包括sD序列或核糖體結合位點(RBS)；②mRNA5’端編碼區(qū)，主要是起始密碼AUG區(qū)域；③mRNA5’末端帽子形成位點區(qū)域,阻止mRNA的成熟及其向胞漿中的轉運。④前體mRNA外顯子與內含子結合部位,干擾剪切和拼接.⑤mRNApolyA形成位點區(qū)域，阻止mRNA的成熟，降低穩(wěn)定性⑥與其靶mRNA結合形成雜交鏈，容易使RNaseH等核酸酶降解mRNA第三十九頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五

反義RNA技術的特點特異性強操作簡便，靶mRNA范圍廣安全性較好抑制基因表達的效率不穩(wěn)定穩(wěn)定性方面的改進：對于直接導入細胞的反義核酸，可以使用氨基磷酸核苷酸、硫代磷酸核苷酸等經(jīng)過化學修飾的底物進行合成，可以更好的抵抗核酸酶的破壞。另外需要增加核酸進入細胞的能力，例如用脂質體包裹、與多聚賴氨酸等連接對于體內表達，可在反義DNA片段的5‘端、3’端加上多余的序列，形成5‘端、3’端的發(fā)卡結構，抵御核酸酶降解。第四十頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五（2）共抑制在宿主中導入單個或多個基因拷貝后引起轉入的基因表達受到抑制，若轉入基因在染色體上有同源基因，還可同時抑制染色體上同源基因的表達該現(xiàn)象首先在植物中發(fā)現(xiàn)，其機制非常復雜，可能和轉錄中及轉錄后的基因沉默有關，是植物抵抗外來核酸入侵（如病毒）的一種反應

1990年，Napoli等為了加深牽牛花的顏色，轉入了多拷貝的牽?；ㄉ睾铣苫颍ň幋a查兒酮合成酶,可催生紅色素），但在部分牽?；ㄖ邪l(fā)現(xiàn)顏色沒有變深，反而變淺，甚至部分花朵為純白色。轉基因沉默可以發(fā)生在染色體上、轉錄和轉錄后三種不同的層次上。發(fā)生在染色體上的轉基因沉默叫做位置效應，發(fā)生在RNA轉錄水平上的轉基因沉默叫做轉錄失活(transcriptionalinactivation)，而發(fā)生在轉錄后水平的轉基因沉默的主要形式是轉錄后共抑制(post-transcriptionalcosunpression)，共抑制對真核細胞的基因表達是一個障礙。第四十一頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五位置效應：轉入基因（可以是單拷貝）在寄主染色體基因組上的插入部位及其周圍的核苷酸組成，對入轉基因表達活性的影響。轉錄活躍的常染色質區(qū)

重復序列區(qū)、異染色質區(qū)、病毒附近等甲基化強烈、染色體濃縮，引起轉基因的沉默轉錄水平的基因沉默：主要是由于啟動子區(qū)發(fā)生甲基化或是導入的基因發(fā)生異染色質化所造成的，二者都和轉入基因重復序列有密切關系

外源基因如果以多拷貝的形式整合到染色體DNA的同一位點上，則不能進行轉錄，故而稱為轉錄失活，且拷貝數(shù)越多，基因沉默現(xiàn)象也就越嚴重。轉錄后水平的基因沉默：主要是轉錄后共抑制(post-transcriptionalcosuppression)現(xiàn)象。

轉錄后水平基因沉默的特點是，外源基因能夠轉錄成mRNA但不能積累，mRNA一經(jīng)合成就被降解或被相應的反義RNA或蛋白質封閉，從而失去合成蛋白質的功能（機理同RNAi類似）。同時具有擴散性。

第四十二頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五依賴于同源性的基因沉默轉基因小鼠中帶有多個拷貝的-球蛋白基因，隨著位點特異性重組的發(fā)生，基因拷貝數(shù)降低，而小鼠體內-球蛋白基因含量增加，同時隨著拷貝數(shù)的減少，該位點處的甲基化程度也降低。-球蛋白基因第四十三頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是由雙鏈RNA(double-strandedRNA，dsRNA)引發(fā)的轉錄后基因靜默機制.RNAi是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制轉座子活動、調控基因表達的監(jiān)控機制.目前已成功用于基因功能和信號轉導系統(tǒng)上下游分子相互關系的研究隨著研究的不斷深入，RNAi的機制正在被逐步闡明，而同時作為功能基因組研究領域中的有力工具（3）RNAi第四十四頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五1995年，1995年Guo和Kemphues用反義RNA技術阻斷秀麗新小桿線蟲,發(fā)現(xiàn)注射正義RNA（senseRNA）和反義RNA均能有效并特異性地抑制秀麗新小桿線蟲par-1基因的表達，該結果不能使用反義RNA技術的理論做出合理解釋。直到1998年，F(xiàn)ire等證實Guo等發(fā)現(xiàn)的正義RNA抑制同源基因表達的現(xiàn)象是由于體外轉錄制備的RNA中污染了微量dsRNA而引發(fā)，并將這一現(xiàn)象命名為RNAi。

此后dsRNA介導的RNAi現(xiàn)象陸續(xù)發(fā)現(xiàn)于真菌、果蠅、擬南芥、錐蟲、水螅、渦蟲、斑馬魚等多種真核生物中，并逐漸證實植物中的轉錄后基因沉默（posttranscriptionalgenesilencing，PTGS）、共抑制（cosuppression）及RNA介導的病毒抗性、真菌的抑制（quelling）現(xiàn)象均屬于RNAi在不同物種的表現(xiàn)形式。2006年，F(xiàn)ire和Mello因為發(fā)現(xiàn)RNAi的機理而獲得諾貝爾生理醫(yī)學獎第四十五頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五

（1）當病毒基因、人工轉入基因、轉座子等外源性基因隨機整合到宿主細胞基因組內，并利用宿主細胞進行轉錄時，常產(chǎn)生一些dsRNA。（2）宿主細胞對這些dsRNA迅即產(chǎn)生反應，其胞質中的核酸內切酶Dicer將dsRNA切割成多個具有特定長度和結構的小片段雙鏈RNA（大約21～23bp），即siRNA。（3）siRNA在細胞內RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義siRNA再與體內一些酶(包括內切酶、外切酶、解旋酶等)結合形成RNA誘導的沉默復合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。

RNAi的作用機理第四十六頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五（4）RISC與外源性基因表達的mRNA的同源區(qū)進行特異性結合，RISC具有核酸酶的功能，在結合部位切割mRNA，切割位點即是與siRNA中反義鏈互補結合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細胞針對這些mRNA的降解反應。（5）siRNA不僅能引導RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結合并在RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級siRNA，從而使RNAi的作用進一步放大，最終將靶mRNA完全降解。第四十七頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五應用：構建發(fā)卡RNA干擾構件或兩端都有啟動子的小基因片段來實現(xiàn)基因失活第四十八頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五RNAi干擾現(xiàn)象的重要特征RNAi是轉錄后水平的基因沉默機制；RNAi具有很高的特異性，只降解與之序列相應的單個內源基因的mRNA；RNAi抑制基因表達具有很高的效率，表型可以達到缺失突變體表型的程度，而且相對很少量的dsRNA分子(數(shù)量遠遠少于內源mRNA的數(shù)量)就能完全抑制相應基因的表達，是以催化放大的方式進行的；RNAi抑制基因表達的效應可以穿過細胞界限，在不同細胞間長距離傳遞和維持信號甚至傳播至整個有機體以及可遺傳等特點;dsRNA不得短于21個堿基，并且長鏈dsRNA也在細胞內被Dicer酶切割為21bp左右的siRNA，并由siRNA來介導mRNA切割。而且大于30bp的dsRNA不能在哺乳動物中誘導特異的RNA干擾，而是細胞非特異性和全面的基因表達受抑和凋亡；ATP依賴性：在去除ATP的樣品中RNA干擾現(xiàn)象降低或消失顯示RNA干擾是一個ATP依賴的過程?？赡苁荄iecer和RISC的酶切反應必須由ATP提供能量。第四十九頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五（4）核酶核酶：具有催化作用的RNA分子，能對單鏈RNA分子進行特異性切割或連接。1982年，Cech等研究原生動物四膜蟲rRNA時，首次發(fā)現(xiàn)rRNA基因轉錄產(chǎn)物的I型內含子的剪切及外顯子的拼接過程可在無任何蛋白質存在的情況下發(fā)生，證明了RNA具有催化功能。1983年Altman等人在研究細菌RNaseP時發(fā)現(xiàn)，它具有兩個組分：一條RNA鏈（稱為M1-RNA）和一個蛋白質（稱為C5蛋白）。它的功能是剪切tRNA分子上多余的或前體序列。而在體外當約400個核苷酸的M1-RNA單獨存在時，也具有完成切割tRNA前體的功能，C5起著提高底物與RNaseP親和力的作用4.1核酶定義及種類第五十頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五

核酶的發(fā)現(xiàn)，從根本上改變了以往只有蛋白質才具有催化功能的概念，為此，Cech和Altman也因此獲得了1989年的諾貝爾化學獎。目前主要有四類自體剪切型核酶：錘頭狀核酶，發(fā)夾狀核酶，瓦庫德衛(wèi)星序列核酶（Varkudsatellite）和丁型肝炎病毒核酶（Hepatitisdeltavirusribozyme）剪接型核酶：為內含子，分為I型（內含子不成環(huán)）和II型（內含子成環(huán)）剪切型核酶：自體剪切型與異體剪切型（RNaseP）第五十一頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五hairpinhepatitisdeltavirushammerhead瓦庫德衛(wèi)星序列核酶含150個以上的核苷酸，是目前發(fā)現(xiàn)的分子量最大結構最復雜的自切型核酶每一類核酶都有序列保守的催化中心，天然核酶均發(fā)生順式作用進行自裂解。錘頭狀核酶的研究最深入、其在基因工程中的應用最具潛力。二級結構自切型核酶第五十二頁，共六十四頁，編輯于2023年，星期五錘頭狀核酶的裂解位點：5′-NUX-3′N為任意堿基，X是除G之外的任意堿基，目前發(fā)現(xiàn)的天然核酶中，裂解位點5′-GUC-3′最為常見。雖然天然核酶只能發(fā)生順式作用，但是可