基因工程的基本操作步驟

基因工程的基本操作步驟第一頁(yè)，共二十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五思考:利用大腸桿菌產(chǎn)生人胰島素的大致培育過(guò)程?

基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞四、目的基因的檢測(cè)與鑒定第二頁(yè)，共二十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五一、目的基因的獲取主要是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子?，F(xiàn)代獲取方法：1、從基因文庫(kù)中獲取目的基因2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因3、化學(xué)方法人工合成初始目的基因的來(lái)源從生物中直接獲取人工合成第三頁(yè)，共二十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五1、從基因文庫(kù)中獲取目的基因

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫(kù)。第四頁(yè)，共二十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存基因組文庫(kù)例：基因文庫(kù)的構(gòu)建方法之一第五頁(yè)，共二十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五某種生物的單鏈mRNA單鏈互補(bǔ)DNA雙鏈cDNA片段導(dǎo)入受體菌中儲(chǔ)存與載體連接cDNA文庫(kù)反（逆）轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄法：cDNA的合成流程圖解例：基因文庫(kù)的構(gòu)建方法之一第六頁(yè)，共二十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)的主要區(qū)別

文庫(kù)類型cDNA文庫(kù)

基因組文庫(kù)

文庫(kù)大小基因中啟動(dòng)子（具有啟動(dòng)作用的DNA片段）基因中內(nèi)含子(位于編碼蛋白質(zhì)序列的非編碼DNA片段）

基因多少

物種間的基因交流小大無(wú)有無(wú)有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以第七頁(yè)，共二十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五怎樣從基因文庫(kù)中得到我們所需要的目的基因呢？第八頁(yè)，共二十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)?？梢栽诙虝r(shí)間內(nèi)獲得大量目的基因。第九頁(yè)，共二十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五循環(huán)變性退火延伸第十頁(yè)，共二十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五(二)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因第十一頁(yè)，共二十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較PCR技術(shù)DNA復(fù)制相同點(diǎn)原理原料條件不同點(diǎn)解旋方式場(chǎng)所酶結(jié)果堿基互補(bǔ)配對(duì)四種脫氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復(fù)制細(xì)胞核內(nèi)熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個(gè)DNA分子第十二頁(yè)，共二十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五二.基因表達(dá)載體的構(gòu)建-----------核心復(fù)制原點(diǎn)+啟動(dòng)子+目的基因+終止子+標(biāo)志基因它們各自的作用是什么?第十三頁(yè)，共二十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)第十四頁(yè)，共二十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程質(zhì)粒DNA分子限制酶處理兩個(gè)切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種一個(gè)切口兩個(gè)黏性末端第十五頁(yè)，共二十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五①載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu)②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵③啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少④目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。注意第十六頁(yè)，共二十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞轉(zhuǎn)化常用的受體細(xì)胞：

有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動(dòng)植物細(xì)胞等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。第十七頁(yè)，共二十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞轉(zhuǎn)化基因槍法花粉管通道法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法第十八頁(yè)，共二十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞顯微注射技術(shù)提純基因表達(dá)載體體外顯微注射入受精卵受精卵移植第十九頁(yè)，共二十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞顯微注射技術(shù)3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞用Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子第二十頁(yè)，共二十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五1、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因(關(guān)鍵步驟)①.首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針③.使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中（1）方法:DNA分子雜交（2）過(guò)程:四、目的基因的檢測(cè)與鑒定第二十一頁(yè)，共二十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五歸納步驟第二十二頁(yè)，共二十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五（二）、鑒定（個(gè)體生物學(xué)水平）2、檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA3、檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等①方法:分子雜交技術(shù)方法:抗原抗體雜交②過(guò)程:

用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA第二十三頁(yè)，共二十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五四、目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)—鑒定——①檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA

上是否插入了目的基因②檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲(chóng)鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等DNA分子雜交分子雜交（注意與上不同之處）抗原—抗體雜交第二十四頁(yè)，共二十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測(cè)與鑒定1、從基因文庫(kù)中獲取目的基因2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因3、化學(xué)方法人工合成復(fù)制原點(diǎn)+目的基因+啟動(dòng)子+終止子+標(biāo)記基因農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法、顯微注射法、感受態(tài)細(xì)胞法DNA分子雜交技術(shù)、分子雜交技術(shù)、抗原—抗體雜交技術(shù)分子檢測(cè)外的個(gè)體水平鑒定第二十五頁(yè)，共二十六頁(yè)，編輯于2023年，星期五鞏固練習(xí):1.人們常選用的細(xì)菌質(zhì)粒分子往往帶有一個(gè)抗生素抗性基因,該抗性基因的主要作用是()A.提高受體細(xì)胞在自然環(huán)境中的耐藥性B.