基因工程的基本操作程序白齊

基因工程的基本操作程序白齊第一頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五基因工程的基本操作程序1、目的基因的獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測(cè)與鑒定第二頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五1.目的基因主要是指：

_______________________編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因2.獲取目的基因的常用方法（1）從基因文庫中獲?。?）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（3）人工合成一、獲取目的基因第三頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五①概念：

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存,各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫（1）從基因文庫中獲取目的基因提取某種生物的全部DNA一定大小的許多DNA片段重組DNA分子(攜帶目的基因)限制酶與載體連接受體細(xì)胞(基因文庫)篩選出產(chǎn)生特定性狀的受體細(xì)胞導(dǎo)入外源DNA擴(kuò)增目的基因分離第四頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五②種類1.基因組文庫:2.部分基因文庫（如cDNA文庫）基因文庫中包含了一種生物的所有基因,這種基因文庫叫做基因組文庫基因文庫中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫.優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單缺點(diǎn)：工作量大，盲目性強(qiáng)③從基因文庫中獲取目的基因第五頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五基因組文庫與部分基因文庫的關(guān)系第六頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五？為什么要構(gòu)建基因文庫？直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取可以嗎？如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段等情況，往往就需要構(gòu)建基因文庫。如果所需要的目的基因序列已知，可以通過PCR等方式獲得，則不需要構(gòu)建基因文庫。尋根問底第七頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五鞏固訓(xùn)練1、構(gòu)建基因組DNA文庫時(shí)，首先應(yīng)分離細(xì)胞的（）

A.染色體DNA

B.線粒體DNAC.總mRNA

D.tRNA2、目的基因可從基因文庫中獲得，下列有關(guān)基因文庫的描述正確的是（）A.某生物的全套基因就是一個(gè)基因文庫B.將含有某種生物不同的許多DNA片段，導(dǎo)入某個(gè)生物體內(nèi)，則這個(gè)生物就是一個(gè)基因文庫C.含有一種生物所有基因的基因文庫叫做基因組文庫D.含有多種生物的一部分基因的基因文庫叫cDNA文庫AC第八頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五（2）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因1.PCR——多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一項(xiàng)生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。通過此技術(shù)，可以在短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因。2.原理：DNA復(fù)制要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物3.前提：第九頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五四種脫氧核苷酸

一對(duì)引物：耐熱的DNA聚合酶(Taq酶）模板DNA(需含有目的基因)

4.條件：與目的基因的起始段互補(bǔ)。5.方式：以_____方式擴(kuò)增，即____（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）6.結(jié)果：指數(shù)2n使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬倍地?cái)U(kuò)增第十頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五7.過程：變性、復(fù)性、延伸三步曲①變性：加熱至90～95℃雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA②復(fù)性：冷卻至50～60℃兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合③延伸：加熱至70～75℃溶液中的四種脫氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。變性復(fù)性延伸第十一頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五DNA復(fù)制PCR技術(shù)場(chǎng)所解旋方式溫度條件酶特點(diǎn)結(jié)果聯(lián)系PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較細(xì)胞內(nèi)溫和的條件需控溫,在較高溫度下進(jìn)行DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋半保留復(fù)制、邊解旋邊復(fù)制半保留復(fù)制、全解旋再?gòu)?fù)制體外細(xì)胞內(nèi)(主要在細(xì)胞核內(nèi))大量的DNA片段(基因)形成整個(gè)DNA分子耐熱的DNA聚合酶(Taq酶)DNA聚合酶、解旋酶等①模板:均需要

作為模板進(jìn)行物質(zhì)合成②原料:均為四種

.

③酶:均需要

進(jìn)行催化④引物:均需要引物，使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸

脫氧核苷酸DNA聚合酶脫氧核苷酸鏈第十二頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五1.下列有關(guān)PCR過程的敘述中不正確的是（）A．變性過程中破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對(duì)之間的氫鍵，也可利用解旋酶實(shí)現(xiàn)B．復(fù)性過程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合是依靠堿基互補(bǔ)配對(duì)原則完成C．延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP、四種核糖核苷酸D．PCR與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相比所需要酶的最適溫度較高C鞏固訓(xùn)練第十三頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五

2.在遺傳工程中，若有一個(gè)控制有利性狀的DNA分子片段為ATGTG／TACAC，要使其數(shù)量增多，可用PCR技術(shù)進(jìn)行人工復(fù)制，復(fù)制時(shí)應(yīng)給予的條件是()①雙鏈DNA分子為模板

②ATGTG或TACAC模板鏈③四種脫氧核苷酸④四種核苷酸⑤DNA聚合酶⑥熱穩(wěn)定DNA聚合酶⑦引物⑧溫度變化⑨恒溫

A.①③④⑦⑧⑨

B.①②④⑥⑦⑧

C.①②⑤⑥⑦⑨

D.①③⑥⑦⑧D第十四頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五（3）人工合成1.逆(反)轉(zhuǎn)錄法2.化學(xué)合成法補(bǔ)充：基因的結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)內(nèi)含子原核細(xì)胞真核細(xì)胞外顯子RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子轉(zhuǎn)錄終止第十五頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)內(nèi)含子外顯子真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列:有調(diào)控作用,上游有啟動(dòng)子，下游有終止子非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游第十六頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五外顯子對(duì)應(yīng)的RNA序列內(nèi)含子對(duì)應(yīng)的RNA序列成熟的mRNA轉(zhuǎn)錄編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子內(nèi)含子真核生物的轉(zhuǎn)錄過程末成熟的mRNA剪接內(nèi)含子(有關(guān)酶的作用下)第十七頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)DNA聚合酶有關(guān)的酶RNA聚合酶mRNA前體mRNA單鏈DNAcDNA逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄剪接逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制啟動(dòng)子終止子基因不含非編碼系列。即不含非編碼區(qū)和內(nèi)含子(以真核生物的逆轉(zhuǎn)錄過程為例)1.逆(反)轉(zhuǎn)錄法第十八頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五求異思維

你能推測(cè)出由mRNA反轉(zhuǎn)錄形成cDNA的過程大致分為哪些步驟嗎？cDNA合成過程是：①反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。②核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。③以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。第十九頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五2.化學(xué)合成法蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核甘酸序列基因的核苷酸序列目的基因DNA合成儀合成推測(cè)推測(cè)——根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNADNA合成儀第二十頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五一、目的基因的獲取1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增3、人工合成:逆(反)轉(zhuǎn)錄法化學(xué)合成法種類基因組文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫課堂小結(jié)：（種類最多）（數(shù)量最多）（針對(duì)性最強(qiáng)）第二十一頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五1、在已知氨基酸序列信息的情況下，獲取目的基因的最方便方法是()A、化學(xué)合成法

B、基因組文庫法C、cDNA文庫法

D、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)2、下列獲取目的基因的方法中需要模板鏈的是()①?gòu)幕蛭膸熘蝎@取目的基因②利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因③反轉(zhuǎn)錄法④通過DNA合成儀利用化學(xué)方法人工合成A．①②③④B．①②③C．②③④ D．②③AD鞏固訓(xùn)練第二十二頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建

——基因工程的核心1、目的：①使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代。②使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。第二十三頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心（1）用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個(gè)切口，露出____________。（2）用___________切割目的基因，使其產(chǎn)生_________________。（3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個(gè)重組

DNA分子(重組質(zhì)粒)限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同2.過程:目的基因與運(yùn)載體的結(jié)合過程，實(shí)際上是不同來源的基因重組的過程。第二十四頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五3、基因表達(dá)載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動(dòng)子c、終止子d、標(biāo)記基因e、復(fù)制原點(diǎn)啟動(dòng)子目的基因復(fù)制原點(diǎn)終止子標(biāo)記基因表達(dá)載體表達(dá)載體的模式圖表達(dá)載體第二十五頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五啟動(dòng)子目的基因復(fù)制原點(diǎn)終止子標(biāo)記基因表達(dá)載體表達(dá)載體的模式圖終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，使轉(zhuǎn)錄終止。標(biāo)記基因：為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而篩選出含有目的基因的受體細(xì)胞。啟動(dòng)子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)。第二十六頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五①載體與表達(dá)載體的區(qū)別：二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點(diǎn)兩部分DNA片段。表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了

、

、

三部分結(jié)構(gòu)②用到的工具酶：既用到

切割載體，又用到

將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是

。③啟動(dòng)子、終止子對(duì)于目的基因表達(dá)必不可少④目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞，必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。注意：目的基因啟動(dòng)子終止子限制酶DNA連接酶磷酸二酯鍵第二十七頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五思考與探究：1.作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？不可以，因?yàn)槟康幕蛟诒磉_(dá)載體中得到表達(dá)并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動(dòng)子、終止子和標(biāo)記基因等。第二十八頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五1.(多選)一個(gè)基因表達(dá)載體的構(gòu)建應(yīng)包括()A．目的基因B．啟動(dòng)子

C．終止子D．標(biāo)記基因2.下列關(guān)于基因表達(dá)載體的敘述不正確的是()A．啟動(dòng)子是與RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，是起始密碼B．啟動(dòng)子和終止子都是特殊結(jié)構(gòu)的DNA短片段，對(duì)mRNA的轉(zhuǎn)錄起調(diào)控作用C．標(biāo)記基因是為了鑒別受體細(xì)胞中是否有目的基因從而便于篩選D．基因表達(dá)載體的構(gòu)建視受體細(xì)胞及導(dǎo)入方式不同而有所差別ABCDA鞏固訓(xùn)練第二十九頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五第三十頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五受體細(xì)胞具備的條件：

沒有與運(yùn)載體相同的質(zhì)?；驔]有與運(yùn)載體質(zhì)粒相同的標(biāo)記基因。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞(一)轉(zhuǎn)化：(二)方法將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(常用)基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+法處理法(感受態(tài)細(xì)胞法)目的基因進(jìn)入_________內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持_____和_____的過程受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)第三十一頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法第三十二頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(常用)①農(nóng)桿菌：

植物的受傷組織會(huì)產(chǎn)生一些糖類和酚類物質(zhì)吸引根瘤農(nóng)桿菌向受傷組織集中，使植物形成腫瘤。

此糖類和酚類物質(zhì)主要在雙子葉植物細(xì)胞壁中合成，通常不存在于單子葉植物中，農(nóng)桿菌易感染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。思考與探究：2.根據(jù)農(nóng)桿菌可將目的基因?qū)腚p子葉植物的機(jī)理,你能分析出農(nóng)桿菌不能將目的基因?qū)雴巫尤~植物的原因嗎?第三十三頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上。②原理：第三十四頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五③轉(zhuǎn)化過程:Ti質(zhì)粒目的基因構(gòu)建表達(dá)載體導(dǎo)入植物細(xì)胞插入植物細(xì)胞染色DNA表達(dá)新性狀轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌第三十五頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五

基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入受體細(xì)胞中，使目的基因與其整合并表達(dá)的方法。（2）基因槍法適用于單子葉植物第三十六頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五（3）花粉管通道法適用于被子植物我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)的一種方法,我國(guó)的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是用這種方法獲得的第三十七頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五

植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進(jìn)入受體細(xì)胞。滴加目的基因溶液（3）花粉管通道法第三十八頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞（1）方法：顯微注射法（將基因表達(dá)載體提純，用顯微儀注射到受精卵中）思考：為什么要用受精卵而不用體細(xì)胞？受精卵具有體積大,易操作,經(jīng)培養(yǎng)可直接表達(dá)性狀的優(yōu)點(diǎn)。而動(dòng)物體細(xì)胞的全能性受限。第三十九頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五（2）操作程序:提純含目的基因表達(dá)載體受精卵顯微注射移植到子宮新性狀動(dòng)物早期胚胎培養(yǎng)2.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞第四十頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五常用法：Ca2+處理細(xì)胞法

(Ca2+增加細(xì)菌細(xì)胞的通透性)常用菌：大腸桿菌微生物作受體細(xì)胞原因：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)少過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞細(xì)菌能夠吸收DNA的狀態(tài)第四十一頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五1、基因工程中科學(xué)家常用細(xì)菌、酵母菌等微生物作為受體細(xì)胞，原因是（）

A．結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、操作方便B．繁殖速度快C．遺傳物質(zhì)含量少、簡(jiǎn)單D．性狀穩(wěn)定、變異少2、基因工程常用的受體細(xì)胞有（）①大腸桿菌②枯草桿菌③支原體④動(dòng)植物細(xì)胞A．①②③④B．①②③C．②③④D．①②④BD3、基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)施工的，在基因操作的基本步驟中,不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的步驟是()A.人工合成基因B.目的基因與運(yùn)載體結(jié)合C.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞D.目的基因的檢測(cè)和表達(dá)C鞏固訓(xùn)練第四十二頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五4.采用基因工程的方法培育抗蟲棉，下列導(dǎo)入目的基因的做法正確的是()①將毒素蛋白質(zhì)注射到棉受精卵中②將編碼毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中③將編碼毒素蛋白的DNA序列與細(xì)菌質(zhì)粒重組，注射到棉的子房并進(jìn)入受精卵中④將編碼毒素蛋白的DNA序列與質(zhì)粒重組，導(dǎo)入細(xì)菌感染棉的體細(xì)胞，再進(jìn)行組織培養(yǎng)A．①②B．②③C．③④D．①④C5.下列屬于基因工程中導(dǎo)入目的基因方法的是()①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法②基因槍法③花粉管道法④顯微注射法⑤胚胎移植⑥D(zhuǎn)NA分子雜交法A．①②③④⑤⑥B．①②③④⑤C．①②③④D．①③④⑤⑥C第四十三頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五四、目的基因的檢測(cè)與鑒定——檢查是否成功(一)分子水平檢測(cè)(二)個(gè)體水平鑒定1.檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA

上是否插入了目的基因2.檢測(cè)目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA3.檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定,抗病鑒定,活性鑒定等方法：DNA分子雜交(DNA和DNA)方法：分子雜交(DNA和mRNA)方法：抗原-抗體雜交第四十四頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五1、檢測(cè)轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因。①首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA；（1）方法:DNA分子雜交（2）過程:②

將含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記,以此做探針；③

使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明染色體已插入染色體DNA中。（一）分子檢測(cè)第四十五頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五DNA分子雜交示意圖

采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個(gè)單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列，那么，互補(bǔ)的堿基序列就會(huì)結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補(bǔ)堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。第四十六頁，共五十二頁，編輯于2023年，星期五DNA附著在膜上硝酸纖維素膜加探針報(bào)告基因（含熒光素分