快速斑點免疫滲濾試驗診斷日本血吸蟲病的初步研究

快速斑點免疫滲濾試驗診斷日本血吸蟲病的初步研究【摘要】目的探討快速斑點免疫滲濾試驗診斷日本血吸蟲病的實用價值，尋找適用于該實驗的最佳診斷抗原。方法(1)分別制備日本血吸蟲雌、雄成蟲及蟲卵粗抗原與組分抗原，并預(yù)制成抗原片。(2)采用FDIFA和常規(guī)ELISA法分別檢測血吸蟲病患者血清33份，健康人血清32份，肝吸蟲病、肺吸蟲病及豬囊蟲病患者血清各5份，比較了日本血吸蟲雌、雄蟲及蟲卵抗原的敏感性和特異性。(3)以χ2檢驗作統(tǒng)計學(xué)處理和分析。結(jié)果日本血吸蟲雌、雄成蟲及蟲卵的組分抗原用于FDIFA，其敏感性好于粗抗原，且特異性亦較好；同時，雄蟲抗原好于雌蟲抗原，蟲卵抗原好于成蟲抗原，但它們之間并差異無顯著性。結(jié)論日本血吸蟲卵組分抗原用于FDIFA診斷日本血吸蟲病，具有較好的敏感性和特異性；但抗原分離、純化方法及實驗過程仍需進一步優(yōu)化。

【關(guān)鍵詞】日本血吸蟲；快速斑點免疫滲濾試驗(FDIFA)；ELISA；組分抗原

【Abstract】ObjectiveToexplorediagnosticeffectofschistosomiasisjaponicumbyfast-dot-immunofiltrationassay(FDIFA)andlookforoptimalantigenstodiagnosethisTheroughandfractionalantigensofmaleandfemaleandeggofSchistosomajaponicumwereprepared.FDIFAandroutineELISAwereappliedtodetectingpatientserumsof33schistosomiasisand32healthycontrolsandotherparasitoses(15cases).ComparedthesensitivityandspecificityoftheseAllfractionalantigenshavegoodsensitivityandFractionalantigensofeggofSchistosomajaponicummaybeappliedtodiagnosisofwasagoodmethodfordiagnosisofschistosomiasis.

【Keywords】Schistosomajaponicum；FDIFA；ELISA；fractionalangtigens；ELISA

日本血吸蟲病分布廣泛，危害嚴重。近年來由于受多種因素影響，我國江湖洲灘地區(qū)有螺面積時有增加，人群感染血吸蟲人數(shù)明顯增多，疫情仍呈上升趨勢。傳統(tǒng)的病原學(xué)方法和常規(guī)免疫診斷技術(shù)在診斷病人、監(jiān)測疫情和大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查方面難以適應(yīng)血防工作的需要。因此，研制簡便、快速、準確、價廉，便于在疫區(qū)推廣應(yīng)用、具有普查、臨床實驗診斷和療效考核價值的檢測方法是當前搞好血防工作的前提條件之一。

常規(guī)ELISA法自20世紀70年代開始應(yīng)用于血吸蟲病診斷，具有較好的敏感性和特異性。但因操作步驟多，實驗時間長，且需要一定的設(shè)備，故較難在基層和現(xiàn)場推廣使用。為了提高ELISA檢測速度，更便于基層及現(xiàn)場調(diào)查時使用，筆者根據(jù)ELISA的實驗原理和本室在測姜片蟲病時的免疫學(xué)方法［1］，稍加改進，建立了快速斑點免疫滲濾試驗(Fast-dot-immunofiltrationassay，F(xiàn)DIFA)，應(yīng)用于血吸蟲病的實驗診斷，并與常規(guī)ELISA法作比較，取得了初步效果?，F(xiàn)報告如下。

1材料與方法

血清來源(1)33份血吸蟲病患者血清均由湖南省血吸蟲病防治研究所提供。(2)32份健康人血清采自本校2004年入學(xué)體檢的非疫區(qū)新生。(3)肝吸蟲病、肺吸蟲病及豬囊蟲病患者血清各5份，均由中國疾病預(yù)防控制中心寄生病預(yù)防控制所提供。所有血清均置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑

硝酸纖維素膜，為Schleicher&Schuell產(chǎn)品。

辣根過氧化物酶(HRP)標記的金黃色葡萄球菌A蛋白由美國進口，工作濃度為1：10000。

四甲基聯(lián)苯胺為Sino-AmericanBiotechnologyCo產(chǎn)品，由上海華美生物工程公司供應(yīng)。臨用前1h配制：先將加入1ml二甲亞砜(DMS)液中溶解，然后加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，再加入25μl30%H2O2，混勻。

封閉液為含1%BSA的pHPBS-Tween20(TBS)緩沖液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

血吸蟲抗原的制備

動物模型的建立成年新西蘭家兔10只，以常規(guī)方法感染1000條日本血吸蟲尾蚴，于感染后42天剖殺，采用門靜脈灌注法收集成蟲。新鮮活蟲立即用生理鹽水漂洗3次，然后分別收集雌、雄蟲。采用朱明東等［2］改進的蟲卵分離新方法［2］，自兔肝獲得純凈日本血吸蟲蟲卵，并收集、分裝在潔凈離心管內(nèi)，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

血吸蟲雌、雄蟲和蟲卵粗抗原的制備取雌蟲450條、雄蟲320條、蟲卵，分別置勻漿器內(nèi)勻漿15min；再置冰浴中超聲粉碎，頻率1500Hz，每次3min，間歇1min，共5次。然后置冰箱冷凍室，反復(fù)凍融3次；最后于4℃下離心1h，上清液即為粗抗原。經(jīng)UV-210紫外分光光度計280/260nm波長測定，計算出各蛋白濃度分別為/ml、/ml、/ml，分裝置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

血吸蟲組分抗原的制備取雌、雄蟲和蟲卵粗抗原各，分別沿管壁緩緩加入層析管，使纖維素與抗原物質(zhì)之間形成界面混勻狀態(tài)。待粗抗原滲入層析柱后，再用/LpH緩沖液不斷滴入層析管，進行洗脫。層析管下端用華氏試管收集洗脫液，每管收集3ml，每種抗原各收集18管。測定3組各管內(nèi)洗脫液的OD值，分別得出3個峰值；各收集峰值前后OD值較高的2～3管洗脫液混合，即可獲得雌、雄蟲和蟲卵3種純化組分抗原。通過SDS和Westernblot分析，組分抗原含有粗抗原的主要免疫反應(yīng)成分，去除了多數(shù)與日本血吸蟲免疫無關(guān)蛋白。經(jīng)島津UV-210紫外分光光度計280/260nm波長測定，計算出各組分蛋白濃度分別為/ml、/ml和/ml，分裝后置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

快速斑點免疫滲濾試驗

稀釋抗原用mol/L碳酸鹽緩沖液分別稀釋3種抗原，其中雌、雄蟲組分抗原稀釋至2μg/ml；蟲卵組分抗原稀釋至μg/ml。

NC圓片制作用內(nèi)徑的打孔器將NC片切割成小圓片，在蒸餾水中浸泡1h，取出晾干。

抗原片制作用6個等大的大頭針柄分別蘸取6種稀釋抗原，印滴在硝NC正面的中央，點樣直徑為，晾干后備用。然后，將晾干的NC小圓片浸于封閉液中2h，晾干后即為抗原片。試驗前，用細胞培養(yǎng)板作載體，將抗原片貼在該自制的FDIFA反應(yīng)板孔中的墊料上，孔內(nèi)墊料為吸水性強的紙質(zhì)。再用雙面膠將抗原片貼于中央帶有小圓孔的橡膠墊圈，然后置于細胞培養(yǎng)板孔中墊料的上面，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用細滴管在抗原片上滴加TBS，每片3滴，逐一緩滴，置28～30℃1min。

按序號將1：10的稀釋血清50μl滴加在抗原片上，待干。

用細滴管在抗原片上滴加TBS，每片3滴，逐一緩滴，洗滌。

用移液器將1：10000酶標結(jié)合物，每片50μl，待滲入。

用細滴管向抗原片上滴加TBS，每片3滴，逐一緩滴，洗滌。

用移液器在抗原片上滴加50滴底物溶液，待5min。若硝酸纖維素膜的中央出現(xiàn)灰藍色斑，即為陽性；而無色或僅為極淡藍色斑，則為陰性。

酶聯(lián)免疫吸附試驗

稀釋抗原用mol/L碳酸鹽緩沖液分別稀釋3種抗原，其中雌、雄蟲組分抗原稀釋至2μg/ml；蟲卵組分抗原稀釋至μg/ml。

包被酶標反應(yīng)板用稀釋過的3種抗原各100μl分別包被酶標反應(yīng)板，平放濕盒內(nèi)，置4℃下8h。

取出反應(yīng)板，棄去包被液，用含1%BSA的TBS100μl封閉，4℃下過夜。

棄去封閉液，用TBS洗滌液沖洗3遍，甩干。然后，于每孔加入1：100稀釋樣本血清，每孔100μl，并設(shè)陽性、陰性和空白對照，置37℃孵育1h。

棄去樣本液，用TBS沖洗3遍，拍干。加1：10000酶標結(jié)合物，每孔100μl，置37℃孵育1h。

以上法沖洗、甩干后，加入現(xiàn)配制的底物，每孔100μl，置暗盒(密封)，室溫下15min。

目測結(jié)果若出現(xiàn)藍色反應(yīng)則為陽性。深藍色為+++，明顯藍色為++，淡藍色為+；無色或極淡藍色則為陰性。

機測結(jié)果每孔加50μl2mol/LH2SO4終止反應(yīng)，用DG-3022酶聯(lián)免疫檢測儀測定結(jié)果。樣本OD值≥陰性對照倍即判為陽性。

2結(jié)果

6種抗原檢測的敏感性見表1、表2

表16種抗原用于FDIFA的敏感性比較*

注：*χ2測驗結(jié)果：P＞，差異無顯著性表26種抗原用于常規(guī)ELISA檢測的敏感性比較*注：*χ2測驗結(jié)果：僅雌蟲組分抗原與粗抗原之間差異有顯著性

用FDIFA檢測血吸蟲病人血清33份，雌蟲、雄蟲、蟲卵3種粗抗原檢測的陽性符合率分別為91%、94%、94%；3種組分抗原檢測的陽性符合率分別為94%、97%、100%。同時，用ELISA法檢測上述血清，結(jié)果3種粗抗原檢測的陽性符合率分別為76%、94%、94%；3種組分抗原檢測的陽性符合率分別為61%、97%、100%。表明FDIFA法略優(yōu)于ELISA法。

6種抗原檢測的特異性

6種抗原用于FDIFA的特異性比較用6種抗原檢測32份正常人血清，結(jié)果除雌蟲組分抗原試驗組顯示3例(%)假陽性外，其余5種抗原試驗組均出現(xiàn)4例(%)假陽性反應(yīng)。

6種抗原用于ELISA的特異性比較用6種抗原檢測32份正常人血清，結(jié)果均出現(xiàn)3例假陽性反應(yīng)。

6種抗原檢測其他寄生蟲病人血清采用FDIFA法和ELISA法分別用6種抗原檢測肝吸蟲、肺吸蟲及豬囊蟲病人血清各5份，結(jié)果均出現(xiàn)1例交叉反應(yīng)，即特異性為80%。因例數(shù)太少，很難說明問題。

3討論

在血吸蟲病防治工作中，尋找簡易、快速、準確，既具有療效考核價值，又能用于疫情監(jiān)測的免疫學(xué)診斷方法，是一個迫切需要解決的問題。以往，在常規(guī)免疫學(xué)診斷中，多以粗抗原進行試驗，故特異性不盡如人意。據(jù)報道，有人對部分現(xiàn)有血吸蟲病診斷試劑進行測試，結(jié)果都有不同程度的交叉反應(yīng)或假陽性出現(xiàn)，尤其是與肝吸蟲病、肺吸蟲病、豬囊蟲病之間的交叉反應(yīng)更甚，因而導(dǎo)致部分病例被誤診，耽擱了診斷和治療［3，4］。

本研究表明：FDIFA的敏感性略好于常規(guī)ELISA，雄蟲抗原好于雌蟲抗原；而蟲卵組分抗原則是最好的抗原，此與文獻報道相一致［5］。在用ELISA法檢測時，雌蟲組分抗原的敏感性明顯低于粗抗原，二者之間差異有顯著性；在應(yīng)用雌蟲粗抗原或組分抗原進行試驗時，F(xiàn)DIFA的敏感性則明顯好于ELISA法，二者之間亦差異有顯著性。

FDIFA與常規(guī)ELISA有相似的敏感性和特異性，不過卻大大簡化了操作步驟。全部操作過程可在10min內(nèi)完成，且取材簡便，成本低廉，無需特殊設(shè)備，其敏感性也有所提高，特別適合于基層和現(xiàn)場使用，具有較好的推廣價值和發(fā)展前景。至于在用該法進行試驗時，與其他寄生蟲病之間存在交叉反應(yīng)現(xiàn)象，其特異性略遜于ELISA法，既表明本法更為敏感，亦提示在其實驗環(huán)節(jié)上亟待改進；同時，抗原分離、純化方法和實驗過程亦有待進一步優(yōu)化。然而，按敏感性≮90%、特異性≮80%；Yauden指數(shù)≥即符合免疫診斷要求的一般規(guī)定，F(xiàn)DIFA法仍不失為一較好的免疫學(xué)診斷方法?！緟⒖嘉墨I】

1仇錦波，邵英遠，傅行禮，等.斑點免疫滲濾試驗診斷姜片蟲病的研究.臨床檢驗雜志，19