牙髓培養(yǎng)細胞體外誘導礦化能力：冠髓與根髓的比較

牙髓培養(yǎng)細胞體外誘導礦化能力：冠髓與根髓的比較【摘要】目的比較人牙髓的根、冠髓培養(yǎng)細胞體外誘導礦化能力，探討牙髓干細胞在牙髓中的定位。方法用組織塊法對人牙的根髓和冠髓細胞進行原代和傳代培養(yǎng)，將第五代培養(yǎng)細胞用條件培養(yǎng)液誘導礦化，在誘導后第10、20、30天對細胞進行VonKossa鈣染色。結果根髓中形成的礦化小結比冠髓中更早、更強烈。結論根髓比冠髓更容易誘導礦化。牙髓干細胞可能存在于根髓和冠髓之中，在根髓中比冠髓中具有更高的密度。

【關鍵詞】牙髓干細胞；細胞培養(yǎng)；礦化結節(jié)

Theinducedmineralizationabilityincultureddentalpulpcells:thecomparationbetweencoronalandrootpulpcells

【Abstract】ObjectiveTocomparethemineralizationabilitybetweencultureddentalrootandcoronalpulpcells,andtoinvestigatethelocalizationofdentalpulpstemcells(DPSCs)indentalpulps.MethodsThehumandentalrootandcoronalpulpcellswereculturedintissue-explantmethod,the5thgenerationofcellsweresubculturedwithconditioningmedium(20%DMEM+10nmol/L+dexamethasone+50mg/Lascorbicacid)toinducemineralization.Atthedaysof10,20,30afterinducing,vonKossaforcalciumstainingwasusedtoinvestigatethemineralizationabilityinrootandcoronalpulpcells.ResultsThemineralizationnodulesappearedearlierandstrongerintherootpulpcellsthanthatinthecoronalpulpcellsobservedinphase-contrastmicroscopeandvonKossastaining.ConclusionRootdentalpulpcellscouldbeinducedtomineralizationmoreeasilythanthecoronalpulpcells.DPSCsmayexistinbothrootandcoronalpulp,anditsdensityintherootpulpishigherthanthatincoronalpulp.

【Keywords】dentalpulpstemcells；cellculture；mineralizationnodules

牙髓干細胞在成體牙髓腔中的定位問題是牙體組織工程學中尚未解決的基本問題。研究表明，體外培養(yǎng)的DPSCs和骨髓干細胞一樣，都具有在一定條件下誘導礦化形成礦化小結的能力，礦化小結的形成是DPSCs分化的標記。本文通過對體外培養(yǎng)的人牙髓髓細胞誘導礦化，并對其礦化能力進行比較，以探討DPSCs在牙髓中的定位。

1材料與方法

主要實驗器材及試劑CO2培養(yǎng)箱；超凈工作臺；相差顯微鏡；細胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板；高速離心機；細胞記數(shù)板；高糖DMEM培養(yǎng)基；胎牛血清；地塞米松；L-抗壞血酸；β-甘油磷酸鈉。

實驗方法

細胞培養(yǎng)收集5顆16～25歲健康人因正畸或阻生而拔出的第三磨牙，在無菌條件下分別取其根髓和冠髓，用組織塊法進行細胞原代和傳代培養(yǎng)［1］，培養(yǎng)液為DMEM。

細胞染色分別將生長狀態(tài)良好的冠髓和根髓細胞接種于有蓋玻片的6孔板上，當細胞匯合約60%～70%時，改用條件培養(yǎng)液，連續(xù)培養(yǎng)30天。在倒置相差顯微鏡下觀察礦化結節(jié)形成情況。分別于10、20、30天時，取出蓋玻片，按VonKossa法進行染色。染色方法取出長有細胞的蓋片，PBS沖洗3遍，F(xiàn)AA固定液中固定30min。蒸餾水沖洗3次。固定后的細胞加入5%的硝酸銀溶液，良好日光下染色1h，蒸餾水沖洗，5%的硫代硫酸鈉作用1～2min，再用蒸餾水洗5min，干后封片，或伊紅復染，常規(guī)脫水后封片。

結果判斷：礦化結節(jié)被染成深黑色。

對照設計體外培養(yǎng)的牙周韌帶細胞具有較強的鈣化能力，用作VonKossa鈣染色的陽性對照片。

2結果

相差顯微鏡下觀察在礦化培養(yǎng)2天時，根髓細胞出現(xiàn)融合現(xiàn)象，細胞間隔消失，冠髓細胞無明顯變化；礦化培養(yǎng)10天時，根髓細胞呈局灶性復層生長，呈網(wǎng)狀或束狀排列；15天時，根髓復層中央部分細胞進一步密集，形成細胞結節(jié)，冠髓細胞開始出現(xiàn)復層生長；礦化培養(yǎng)20天時，根髓細胞結節(jié)中央出現(xiàn)黑色高密度物質沉積，并且隨著時間延長增多，冠髓細胞結節(jié)中央開始出現(xiàn)少量褐色沉積物；礦化30天時，根髓出現(xiàn)明顯的黑色礦化結節(jié)，冠髓中有小而少的礦化結節(jié)出現(xiàn)。

VonKossa法鈣鹽染色

根髓細胞于誘導培養(yǎng)20天時，在細胞結節(jié)中央出現(xiàn)被染成黑褐色的小塊，表明鈣質沉積。誘導培養(yǎng)30天時，黑色小塊進一步增大(見圖1略)。

冠髓細胞20天時，尚無染色陽性礦化結節(jié)形成。30天時，少數(shù)區(qū)域出現(xiàn)礦化結節(jié)，體積較小且強度微弱(見圖2略)。

陽性對照片相同染色條件下體外培養(yǎng)的牙周韌帶細胞出現(xiàn)黑色團塊。

3討論

本實驗發(fā)現(xiàn)體外持續(xù)培養(yǎng)的牙髓細胞在誘導劑作用下經(jīng)歷了融合期、復層生長期、細胞結節(jié)形成期而最后發(fā)生礦化，這與Tsukamoto等［2］的觀察相一致。研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的牙髓細胞能復層生長，在一定條件下能分泌形成類牙本質樣的礦化結節(jié)［3］。結節(jié)中細胞是處在分化中的成牙本質細胞前期,體外培養(yǎng)單層生長的細胞不具有形成礦化基質的能力而牙髓細胞復層生長可以形成細胞結節(jié)，細胞結節(jié)所具有的三維結構是形成鈣化的先決條件［4］。

牙髓干細胞經(jīng)過誘導可以形成礦化結節(jié)，礦化結節(jié)的形成代表了牙髓干細胞的存在。由于礦化的形成是牙髓細胞向成牙本質細胞分化的標志，本實驗在相同誘導條件下根髓比冠髓礦化發(fā)生得早，說明根髓中牙髓干細胞的密度高于冠髓，或者根髓細胞向成牙本質細胞分化的潛能比冠髓細胞大。

對DPSC存在的部位存在著不同的認識。牙齒的發(fā)生是由上皮與間充質相互作用下完成的，根尖區(qū)是牙根的生發(fā)中心。從牙齒發(fā)育學角度考慮，牙髓干細胞主要存在于根尖區(qū)。Harada采用器官培養(yǎng)方法對切牙根尖末端培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)由新分化形成的成釉細胞和成牙本質細胞產(chǎn)生了釉質和牙本質,表明干細胞起源于根尖區(qū)的頸環(huán)上皮［5］。

牙髓是牙齒發(fā)育完成之后存留于牙髓腔中的疏松結締組織，牙髓中的成牙本質細胞可不斷分泌牙本質基質，并礦化形成牙本質。若受到刺激，將導致受刺激部位的成牙本質細胞變性壞死，將由新分化形成的成牙本質細胞取代，并形成修復性牙本質。刺激常發(fā)生于冠部，所以修復性牙本質常出現(xiàn)在冠部。該現(xiàn)象說明牙冠部就存在著能分化為成牙本質細胞的牙髓干細胞,還可能是牙齒受到刺激后，通過Nortch信號傳遞，牙髓干細胞由根部的干細胞遷移分化而來［6］。本實驗通過對培養(yǎng)細胞的相差顯微鏡觀察和茜素紅染色，發(fā)現(xiàn)根、冠髓細胞在一定誘導條件下皆具有形成礦化結節(jié)的能力，說明根髓和冠髓中都存在牙髓干細胞。

對于冠部、根部牙髓組織學特征，Murray等［7］做了研究比較，發(fā)現(xiàn)冠部細胞密度要高于根部，但根部牙本質沉積率卻比冠部高。這種現(xiàn)象說明根部牙本質的高沉積率不是成牙本質細胞的數(shù)量導致的,而與根部成牙本質細胞的功能活躍有關。提示冠部、根部牙本質分泌的機制存在差異。研究發(fā)現(xiàn)隨年齡的增長，根髓較快的發(fā)生退行性變如細胞數(shù)量的減少、纖維增多、髓石形成等。因而可以認為，冠、根部的種種差異與干細胞在冠髓根髓中的密度密切相關。

我們的前期研究發(fā)現(xiàn)［1,8,9］，根髓細胞比冠髓細胞更容易培養(yǎng)，根髓細胞的堿性磷酸酶活性高于冠髓，牙髓細胞經(jīng)體外誘導礦化并經(jīng)茜素紅染色后，根髓比冠髓中具有更強的紅色結節(jié)。這從牙髓干細胞的功能角度說明DPSCs存在于全部牙髓中，而且主要位于根髓之中。

4結論

體外培養(yǎng)的牙髓細胞中礦化小結的形成代表了DPSCs的存在，根部牙髓比冠部牙髓細胞更易于誘導礦化，提示DPSCs存在于根髓和冠髓之中，在根髓中比冠髓中具有更高的密度。

【參考文獻】

1劉少華，魏奉才，孫善珍,等.牙髓細胞的原代培養(yǎng)方法探討：冠部和根部牙髓的比較.上?？谇会t(yī)學，2004，13:103-105.

2TsukamotoY,FukutaniS,Shin-IkeT,etal.Mineralizednoduleformationbyculturesofhumandentalpulp-derivedfibroblasts.ArchOralBiol,1992,37(12):1045-1055.

3AboutI,BotteroMJ,deDenatoP,etal.HumandentinproductioninCellRes,2000,258(1):33-41.

4SudoH,KodamaHA,AmagaiY,etal.Invitrodifferentiationandcalcificationinanewclonalosteogeniccelllinederivedfromnewbornmousecalvaria.JCellBiol,1983,96(1):191-198.

5HaradaH,KettunenP,JungHS,etal.LocalizationofputativestemcellsindentalepitheliumandtheirassociationwithNotchandFGFCellBiol,1999,147(1):105-120.

6MitsiadisTA,HirsingerE,LendahlU,etal.Delta-notchsignalinginodontogenesis:correlationwithcytodifferentiationandevidenceforfeedbackregulation.DevBiol,1998,204(2):420-431.

7MurrayPE,StanleyHR,MatthewsJB,etal.