學(xué)習(xí)情境有機(jī)酸檸檬酸詳解

學(xué)習(xí)情境有機(jī)酸檸檬酸詳解演示文稿當(dāng)前第1頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)優(yōu)選學(xué)習(xí)情境有機(jī)酸檸檬酸當(dāng)前第2頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)檸檬酸1784年由Scheels氏發(fā)現(xiàn)1893年前，主要用柑橘、菠蘿、檸檬等果實(shí)提取檸檬酸1893年德國微生物學(xué)家Wehmer發(fā)現(xiàn)二種青霉菌可以生成檸檬酸1917年Currie使用黑曲霉淺盤發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸1923年美國科學(xué)家研究成功了以廢糖蜜為原料的淺盤法檸檬酸發(fā)酵，并在比利時(shí)設(shè)廠生產(chǎn)。1938年P(guān)erquin和1942年Karrow進(jìn)行了檸檬酸的深層發(fā)酵研究1951年美國Miles公司首先以淀粉質(zhì)為原料，經(jīng)水解后深層發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)檸檬酸。

檸檬酸當(dāng)前第3頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)

檸檬酸我國1953年剛開始也是采用淺盤法發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸，1968年用薯干為原料采用深層發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸成功，由于工藝簡單、原料豐富、發(fā)酵水平高，各地陸續(xù)辦廠投產(chǎn)，至20世紀(jì)70年代中期，檸檬酸工業(yè)已初步形成了生產(chǎn)體系。當(dāng)前第4頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)我國檸檬酸行業(yè)從產(chǎn)量上位居世界第一，從技術(shù)上，在國際上也是處于世界領(lǐng)先水平，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)領(lǐng)先于其他國家，其優(yōu)勢在于：1.我國的檸檬酸發(fā)酵采用的菌種（黑曲霉）具有雙重功能，當(dāng)?shù)矸墼媳灰夯螅纯蛇M(jìn)行發(fā)酵，不需要將淀粉水解成葡萄糖，簡化了生產(chǎn)工藝，降低了生產(chǎn)成本。2.盡管采用邊糖化邊發(fā)酵的工藝，但發(fā)酵周期只有64小時(shí)，生產(chǎn)周期比國外要短。3.檸檬酸的產(chǎn)酸速度大大地高于國外水平。平均產(chǎn)酸速率是國外的2倍。當(dāng)前第5頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)檸檬酸是目前世界上以生物化學(xué)方法生產(chǎn)，產(chǎn)量最大的有機(jī)酸。我國是一個(gè)檸檬酸的生產(chǎn)大國，1995年的產(chǎn)量為16萬噸，1999年底達(dá)到20萬噸，其中80％以上都出口國外，在國際市場上占有重要地位。當(dāng)前第6頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)2000年的產(chǎn)量達(dá)到36.9萬噸，檸檬酸及檸檬酸鹽出口量為25.8萬噸，分別比1999年增長了36.4%和23.3%，為歷史最高水平。2001年世界檸檬酸消費(fèi)量(不含中國)已經(jīng)升至近200萬噸，年遞增率約5%，我國檸檬酸產(chǎn)量約為35萬噸，檸檬酸及檸檬酸鹽出口量為27.8萬噸。2002年我國檸檬酸產(chǎn)量突破了40萬噸，達(dá)到了40.2萬噸，而檸檬酸及檸檬酸鹽出口基本與2001年持平，為28.3萬噸。當(dāng)前第7頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)檸檬酸的消費(fèi)領(lǐng)域：飲料行業(yè)占40～45％食品添加劑等占15～20％洗滌劑占20～30％醫(yī)藥占5％其它占10％2004年全球檸檬酸產(chǎn)量約120萬噸，歐盟和美國為最大消費(fèi)市場。當(dāng)前第8頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)

歐洲是檸檬酸的第二大生產(chǎn)地，產(chǎn)量約30萬噸美國檸檬酸年產(chǎn)量約25萬噸我國是檸檬酸的第一大生產(chǎn)國，估計(jì)年產(chǎn)約50萬噸但在1970年時(shí)，我國的檸檬酸年產(chǎn)僅有130噸當(dāng)前第9頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)我國檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)的回顧和展望我國于五十年代初期開始檸檬酸淺盤發(fā)酵研究，1968年輕工業(yè)部發(fā)酵研究所與黑龍江和平糖廠合作，首先完成了甜菜糖蜜淺盤表面發(fā)酵并投入工業(yè)化生產(chǎn)。1965年，上海市工業(yè)微生物研究所篩選出N558菌種，并與天津工業(yè)微生物研究所，南通發(fā)酵廠等合作，使之用于工業(yè)化生產(chǎn)，并在全國推廣，形成我國獨(dú)特的薯干直接深層發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸。當(dāng)前第10頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)我國檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)的回顧和展望從七十年代到九十年代，我國一直致力于檸檬酸生產(chǎn)菌種的改進(jìn)，1990年，上海市工業(yè)微生物研究所完成國家七五攻關(guān)項(xiàng)目篩選出860菌種，發(fā)酵產(chǎn)酸達(dá)20％，上海市工業(yè)微生物研究所開始以薯渣為主原料，以黑曲霉為菌種，固體發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸鈣的研究。并于1977年中試成功并投入生產(chǎn)，現(xiàn)在全國已有四十余個(gè)工廠，采用固體發(fā)酵法由薯渣生產(chǎn)檸檬酸及檸檬酸鈣產(chǎn)品。當(dāng)前第11頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)我國以石油原料發(fā)酵檸檬酸開始于1970年，先后在天津、上海、沈陽等地進(jìn)行研究，并一度投入小規(guī)模試驗(yàn)生產(chǎn)，是用正烷烴為原料，以解脂假絲酵母為菌種，發(fā)酵產(chǎn)酸達(dá)13％以上，轉(zhuǎn)化率140％以上，但因檸檬酸只占總酸的50%（另一半為異檸檬酸）而且由于成本較高及石油原料緊缺和食用安全性等原因，未能堅(jiān)持研究和生產(chǎn)。當(dāng)前第12頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)我國的發(fā)酵技木及生產(chǎn)水平，特別是菌種及發(fā)酵工藝均為世界領(lǐng)先水平。薯干粉、淀粉、木薯粉、葡萄糖母液等直接深層發(fā)酵技術(shù)為我國所獨(dú)有。國外發(fā)酵罐容積通常在200m3,并較早實(shí)現(xiàn)自動(dòng)控制；我國的最大檸檬酸發(fā)酵罐為150m3當(dāng)前第13頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)一、

檸檬酸在食品中的應(yīng)用

1)

飲料與冰淇淋檸檬酸廣泛用于配制各種水果型的飲料以及軟飲料檸檬酸本身是果汁的天然成分之一，不僅賦于飲料水果風(fēng)味，而且具有增溶、緩沖、抗氧化等作用，能使飲料中的糖、香精、色素等成分交融協(xié)調(diào)，形成適宜的口味和風(fēng)味；添加檸檬酸可以改善冰淇淋的口味，增加乳化穩(wěn)定性，防止氧化作用。當(dāng)前第14頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)2)

果醬與釀造酒檸檬酸在果醬與果凍中同樣可以增進(jìn)風(fēng)味，并使產(chǎn)品抗氧化作用。由于果醬、果凍的凝膠性質(zhì)需要一定范圍的pH值，添加一定量的檸檬酸可以滿足這一要求。當(dāng)葡萄或其它釀酒原料成熟過度而酸度不足時(shí)，可以用檸檬酸調(diào)節(jié)，以防止所釀造的酒口味單薄。檸檬酸加到這些果汁中還有抗氧化和保護(hù)色素的作用，以保護(hù)果汁的新鮮感和防止變色。當(dāng)前第15頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)3)

腌制品

各種肉類和蔬菜在腌制加工時(shí)，加入或涂上檸檬酸可以改善風(fēng)味，除腥去臭，抗氧化。4)

罐頭食品

加入檸檬酸除了調(diào)酸作用之外，還有螯合金屬離子的作用，保護(hù)其中的抗壞血酸，使之不被金屬離子破壞。檸檬酸添加到植物油中也有類似的作用。當(dāng)前第16頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)5)

豆制品及調(diào)味品

用含有檸檬酸的水浸漬大豆，可以脫腥并便于后續(xù)加工。檸檬酸可以用于大豆等豆類蛋白、葵花子蛋白的水解，生產(chǎn)出風(fēng)味別致的調(diào)味品。它也可以用于成熟調(diào)味品（醬油等）的調(diào)味。6)

其它

檸檬酸在醫(yī)藥、化學(xué)等其它工業(yè)中也有一定的作用。檸檬酸鐵胺可以用作補(bǔ)血?jiǎng)?；檸檬酸鈉可用作輸血?jiǎng)?；檸檬酸可制造食品包裝用薄膜及無公害洗滌劑。當(dāng)前第17頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)二、

檸檬酸發(fā)酵微生物

1)

黑曲霉（Aspergillus

niger）的形態(tài)特征

目前生產(chǎn)上常用產(chǎn)酸能力強(qiáng)的黑曲霉作為生產(chǎn)菌。在固體培養(yǎng)基上，菌落由白色逐漸變至棕色。孢子區(qū)域?yàn)楹谏?，菌落呈絨毛狀，邊緣不整齊。菌絲有隔膜和分枝，是多細(xì)胞的菌絲體，無色或有色，有足細(xì)胞，頂囊生成一層或兩層小梗，小梗頂端產(chǎn)生一串串分生孢子。當(dāng)前第18頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)二、

檸檬酸發(fā)酵微生物

2)

黑曲霉（Aspergillus

niger）的生理特征

黑曲霉生產(chǎn)菌可在薯干粉、玉米粉、可溶性淀粉糖蜜、葡萄糖麥芽糖、糊精、乳糖等培養(yǎng)基上生長、產(chǎn)酸。黑曲霉生長最適pH值因菌種而異，一般為pH3~7；產(chǎn)酸最適pH為1.8~2.5。生長最適溫度為33~37℃，產(chǎn)酸最適溫度在28~37℃，溫度過高易形成雜酸，斜面培養(yǎng)要求在麥芽汁4°Be′左右的培養(yǎng)基上。當(dāng)前第19頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)二、

檸檬酸發(fā)酵微生物

黑曲霉以無性生殖的形式繁殖，具有多種活力較強(qiáng)的酶系，能利用淀粉類物質(zhì)，并且對蛋白質(zhì)、單寧、纖維素、果膠等具有一定的分解能力。當(dāng)前第20頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)二、

檸檬酸發(fā)酵微生物

黑曲霉可以邊長菌、邊糖化、邊發(fā)酵產(chǎn)酸的方式生產(chǎn)檸檬酸。

當(dāng)前第21頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)三、檸檬酸發(fā)酵機(jī)理關(guān)于檸檬酸發(fā)酵的機(jī)制有多種理論，目前大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為它與三羧酸循環(huán)有密切的關(guān)系。糖經(jīng)糖酵解途徑(EMP途徑)，形成丙酮酸，丙酮酸羧化形成C4化合物，丙酮酸脫羧形成C2化合物，兩者縮合形成檸檬酸。當(dāng)前第22頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)檸檬酸的溢出代謝：

多種微生物均能因受刺激而過量合成檸檬酸。研究檸檬酸溢出代謝的最好的例子無疑是黑曲霉。黑曲霉之所以能在特定環(huán)境條件下累積檸檬酸，是因?yàn)樵谶@種環(huán)境條件下代謝途徑前段的運(yùn)轉(zhuǎn)速率大于后段的運(yùn)轉(zhuǎn)速率。

檸檬酸的溢出代謝是黑曲霉特有的遺傳和生化機(jī)制與培養(yǎng)條件共同起作用的結(jié)果。

引起溢出代謝的原因包括以下三個(gè)方面：當(dāng)前第23頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)①高水平的檸檬酸合成能力。

這個(gè)能力由3個(gè)因素構(gòu)成。

第一:是在有高濃度草酰乙酸（OAA）的情況下對AcCoA具有高度親和力的組成型的檸檬酸合成酶（CS）的存在；

第二:是催化丙酮酸（PYR）固定CO2生成草酰乙酸反應(yīng)的高水平的組成型的丙酮酸羧化酶（PC）的存在；當(dāng)前第24頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)第三:是在缺少錳的條件下，蛋白質(zhì)分解或蛋白質(zhì)合成受阻造成的銨的高濃度能解除檸檬酸（CTA）對磷酸果糖激酶（PFK）的抑制。

此外，檸檬酸的分泌，降低其胞內(nèi)濃度。當(dāng)前第25頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)②較低的降解檸檬酸的能力。這能力由兩個(gè)因素構(gòu)成。第一是低水平的α-酮戊二酸脫氫酶（KD）影響TCA環(huán)運(yùn)行的暢通程度，使TCA環(huán)前半部的中間產(chǎn)物積壓；第二，在錳缺乏的條件下，順烏頭酸酶（AE）和異檸檬酸脫氫酶（ID）的活性降低，從而使檸檬酸的累積比其它幾種酸（順烏頭酸、異檸檬酸和α-酮戊二酸）更明顯。當(dāng)前第26頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)③在檸檬酸過量合成階段，培養(yǎng)基的pH值顯然會(huì)影響細(xì)胞膜對目的產(chǎn)物檸檬酸的跨膜輸送；

檸檬酸的分泌也會(huì)影響培養(yǎng)基的pH值。

錳與鐵的缺乏有利于檸檬酸的排出。當(dāng)前第27頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)黑曲霉中檸檬酸的代謝溢出GG-6-P(磷酸果糖激酶)檸檬酸,NH4I+A1.6－二磷酸果糖丙酮酸草酰乙酸乙酰CoA檸檬酸順烏頭酸異檸檬酸α-酮戊二酸(丙酮酸羧化酶)(檸檬酸合成酶

)α-酮戊二酸脫氫酶異檸檬酸脫氫酶順烏頭酸酶順烏頭酸酶當(dāng)前第28頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)TCA循環(huán)在檸檬酸積累中的調(diào)節(jié)1)大量生成草酰乙酸是積累檸檬酸的關(guān)鍵；2)丙酮酸羧化酶和檸檬酸合成酶基本上不受代謝調(diào)節(jié)的控制或極微弱;3)TCA循環(huán)的阻斷或微弱(即順烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶和α－酮戊二酸脫氫酶活力降低)，導(dǎo)致檸檬酸積累。而且，當(dāng)檸檬酸濃度超過一定水平，就抑制異檸檬酸脫氫酶活力來提高自身的積累。當(dāng)前第29頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)回補(bǔ)途徑☆TCA循環(huán)重要功能除產(chǎn)能外，為一些氨基酸和其它化合物的合成提供了中間產(chǎn)物；☆生物合成中所消耗的中間產(chǎn)物若得不到補(bǔ)充，循環(huán)就會(huì)中斷；☆回補(bǔ)方式：①通過某些化合物的CO2固定作用，②一些轉(zhuǎn)氨基酶所催化的反應(yīng)也能合成草酰乙酸和-酮戊二酸，③通過乙醛酸循環(huán)當(dāng)前第30頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)★通過某些化合物的CO2固定作用使三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物得到回補(bǔ)：丙酮酸羧化酶：

CO2+丙酮酸+ATP+H2OMg++

草酰乙酸+ADP+Pi磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶:

CO2+PEP+H2O草酰乙酸+H3PO4蘋果酸酶:CO2+丙酮酸+NADPH+H+蘋果酸+NADP+為了能夠在己糖或戊糖的中間代謝物上進(jìn)行好氧生長，異養(yǎng)微生物至少要具備上述幾種酶之種的一個(gè)酶。①

CO2固定作用補(bǔ)充TCA環(huán)的中間產(chǎn)物當(dāng)前第31頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第32頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)②轉(zhuǎn)氨基作用定義：

α-氨基酸的氨基通過酶的催化,轉(zhuǎn)移到α-酮酸

的酮基上,生成相應(yīng)的氨基酸;原來的α-氨基酸則轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的α-酮酸。R1CHNH2+COOHR2C=OCOOHR1C=O+COOHR2CHNH2COOH

轉(zhuǎn)氨酶當(dāng)前第33頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)轉(zhuǎn)氨基作用幾點(diǎn)說明：（1）可逆反應(yīng)，（2）轉(zhuǎn)氨酶的輔酶是磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺（3）重要的轉(zhuǎn)氨酶：

丙氨酸轉(zhuǎn)移酶（ALT）/谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）天冬氨酸轉(zhuǎn)移酶（AST）/谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)

ALT常用于肝疾患（肝炎等）輔助診斷、AST用于心肌疾患（心肌梗塞等的輔助診斷）當(dāng)前第34頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)CH3

H-C-NH2+

COOHCOOH

（CH2）2

C=O

COOH

丙氨酸α-酮戊二酸丙酮酸谷氨酸ALT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶，急性肝炎時(shí)血清ALT

活性顯著增高。ALTCH3

C=O

+

COOHCOOH

（CH2）2

H-C-NH2

COOH當(dāng)前第35頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)COOH

CH2+H-C-NH2

COOHCOOH（CH2）2

C=O

COOHAST

天冬氨酸α-酮戊二酸草酰乙酸谷氨酸AST：谷草轉(zhuǎn)氨酶，心肌梗塞時(shí)血清含量明顯增高.COOH

CH2+C=O

COOHCOOH（CH2）2

H-C-NH2

COOH當(dāng)前第36頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)③乙醛酸循環(huán)草酰乙酸檸檬酸琥珀酸異檸檬酸蘋果酸延胡索酸乙醛酸乙酰CoA乙酰CoA乙酸乙酸當(dāng)前第37頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)乙醛酸循環(huán)能夠利用乙酸的微生物具有乙酰CoA合成酶，它使乙酸轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴oA；然后在異檸檬酸裂解酶和蘋果酸合成酶的作用下進(jìn)入乙醛酸循環(huán)。乙醛酸循環(huán)的主要反應(yīng)：異檸檬酸琥珀酸+乙醛酸乙醛酸+乙酸蘋果酸琥珀酸+乙酸→→→異檸檬酸凈反應(yīng)：2乙酸蘋果酸當(dāng)前第38頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)檸檬酸發(fā)酵機(jī)理檸檬酸的發(fā)酵機(jī)理可概括為：大量的胞內(nèi)NH4+和呼吸活性提高，使通過糖酵解途徑的代謝得到加強(qiáng)．葡萄糖經(jīng)EMP通路分解成為丙酮酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，在丙酮酸脫氫酶復(fù)合物作用下氧化成為乙酰CoA及CO2，然后在檸檬酸合成酶作用下與草酰乙酸縮合而形成檸檬酸，而異檸檬酸脫氫酶、烏頭酸酶因受到抑制，而使檸檬酸得以積累。當(dāng)前第39頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)葡萄糖

丙酮酸+丙酮酸乙酰輔酶A(CH3CO-CoA)CO2固定反應(yīng)+草酰乙酸順烏頭酸酶檸檬酸異檸檬酸異檸檬酸脫氫酶琥珀酸α—KGA（檸檬酸合成酶）檸檬酸發(fā)酵機(jī)理按照正常的微生物菌體的代謝規(guī)律，上述途徑并不能夠積累檸檬酸，而是進(jìn)入TCA循環(huán)，被徹底氧化，檸檬酸產(chǎn)生菌之所以能夠大量積累檸檬酸，其產(chǎn)生菌菌種必須具備一定的內(nèi)在因素，也就是：檸檬酸后述的各種酶，主要是，順烏頭酸酶、異檸檬酸脫氫酶酶

的活性喪失或非常微弱，否則，合成的檸檬酸迅速被降解成其他物質(zhì)。當(dāng)前第40頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)檸檬酸生物合成中的代謝調(diào)節(jié)與控制——追求檸檬酸的高產(chǎn)率檸檬酸是微生物生長代謝過程中的一個(gè)中間性產(chǎn)物，在正常的微生物體內(nèi)不能夠積累的，如果有積累的話，與檸檬酸合成有關(guān)的各種酶的活性，則會(huì)受到抑制或阻遏，那么，檸檬酸發(fā)酵過程中，這種抑制或阻遏是如何被克服的呢？

當(dāng)前第41頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)1.磷酸果糖激酶（PFK）活性的調(diào)節(jié)從葡萄糖→→檸檬酸的合成過程中，PFK是一種調(diào)節(jié)酶或者稱之為關(guān)鍵酶，其酶活性受到檸檬酸的強(qiáng)烈抑制，這種抑制必須解除，否則，檸檬酸合成的途徑就會(huì)因?yàn)樵撁富钚缘囊种贫蛔钄?，停止檸檬酸的合成，……研究表明，微生物體內(nèi)的NH4+，可以解除檸檬酸對PFK的這種反饋抑制作用，在較高的NH4+的濃度下，細(xì)胞可以大量形成檸檬酸，那么NH4+

濃度是如何升高的呢？

在正常情況下，檸檬酸、ATP對磷酸果糖激酶有抑制作用，而AMP、無機(jī)磷、銨離子對該酶則有激活作用，特別是還能解除檸檬酸、ATP對磷酸果糖激酶的抑制作用。銨離子濃度與檸檬酸生成速度有密切關(guān)系，正是由于細(xì)胞內(nèi)銨離子濃度升高，使磷酸果糖激酶對細(xì)胞內(nèi)積累的大量檸檬酸不敏感。當(dāng)前第42頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)1.磷酸果糖激酶（PFK）活性的調(diào)節(jié)

研究表明，檸檬酸產(chǎn)生菌——黑曲霉如果生長在Mn+

缺乏的培養(yǎng)基中，NH4+濃度異常的高，可達(dá)到25mmol/L，顯然，由于Mn+的缺乏，使得微生物體內(nèi)NH4+濃度升高，進(jìn)而解除了檸檬酸對PFK活性的抑制作用，使得葡萄糖源源不斷的合成大量的檸檬酸。當(dāng)前第43頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)Mn+

缺乏如何會(huì)使NH4+濃度升高呢？當(dāng)培養(yǎng)基中Mn+

缺乏時(shí)，NH4+濃度升高，同時(shí)微生物體內(nèi)積累幾種氨基酸（GA谷氨酸、Arg、Gin谷氨酰胺等），這些氨基酸的積累，意味著體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成受阻，而外源蛋白質(zhì)的分解速度則不受到影響，這樣NH4+的消耗下降，NH4+濃度就會(huì)升高，微生物體內(nèi)蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝關(guān)系可以使用下圖示之：氨基酸合成蛋白質(zhì)分解氨基酸氨基化合成氨基酸當(dāng)前第44頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)2.順烏頭酸酶活性的控制該酶的喪失或失活是阻斷TCA循環(huán)，大量生成檸檬酸的必要條件。通常檸檬酸產(chǎn)生菌體內(nèi)該酶的活性本身就要求很弱，但在發(fā)酵過程中仍需要控制它的活性。由于該酶的活性受到Fe2+

的影響，控制培養(yǎng)基中的Fe2+

的濃度，可以使該酶失活。因此，檸檬酸發(fā)酵要求采用不銹鋼反應(yīng)器，目的就是控制培養(yǎng)基中的Fe2+的濃度。但是在檸檬酸發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基中的Fe2+的濃度有要求不能夠低于0.1mg/L，原因目前尚沒有搞清楚。隨著檸檬酸積累，pH降低到一定程度時(shí)，使順烏頭酸酶和異檸檬酸脫氫酶失活(順烏頭酸酶、異檸檬酸酶在pH2.0時(shí)失活)，更有利于檸檬酸的積累及排出細(xì)胞外。當(dāng)前第45頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)順烏頭酸酶的活性：從理論上推測，順烏頭酸酶失活，三羧酸循環(huán)阻斷是累積檸檬酸的必要條件。許多實(shí)驗(yàn)指出順烏頭酸酶活力變化與檸檬酸累積有密切關(guān)系。例如，產(chǎn)酸菌株的順烏頭酸酶活力比非產(chǎn)酸菌株低，產(chǎn)酸期比生長期低，生長在產(chǎn)酸培養(yǎng)基上菌株的順烏頭酸酶活比生長在非產(chǎn)酸培養(yǎng)基上的低。添加順烏頭酸酶抑制劑可促進(jìn)檸檬酸積累。鐵為順烏頭酸酶的激活劑，用亞鐵氰化鉀除鐵，可以握高檸檬酸產(chǎn)率。當(dāng)前第46頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)那么，解決了檸檬酸發(fā)酵過程中的上述幾個(gè)問題：……，是不是就意味著可以將葡萄糖源源不斷的轉(zhuǎn)化成檸檬酸呢？

提問：根據(jù)微生物代謝調(diào)節(jié)的基本理論，還需要解決什么問題？當(dāng)前第47頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)菌體要大量合成檸檬酸，從葡萄糖經(jīng)過EMP到檸檬酸整個(gè)代謝途徑需要暢通，在這個(gè)過程中：丙酮酸氧化脫羧，每分子丙酮酸可產(chǎn)生一分子的NADH，在有氧的條件下，每分子的NADH經(jīng)過呼吸鏈徹底氧化成H2O，并氧化磷酸化產(chǎn)生3分子的ATP，造成了微生物體內(nèi)能荷的增加，能荷增加則抑制PFK等關(guān)鍵酶的酶活性，使得從葡萄糖到檸檬酸的代謝停止，怎么能夠大量合成檸檬酸呢？3.能荷調(diào)節(jié)對檸檬酸發(fā)酵的影響當(dāng)前第48頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)如果NADH（還原型）不能夠快速的被氧化轉(zhuǎn)變成NAD（氧化型），則整個(gè)反應(yīng)就會(huì)因?yàn)槿狈ψ鳛橥苿?dòng)力的氧化型的NAD而停止，仍然不能夠合成檸檬酸。當(dāng)前第49頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)檸檬酸產(chǎn)生菌可在有氧的條件下大量生成檸檬酸，也就是說，NADH即被氧化了，又沒有產(chǎn)生ATP。為了解釋這種現(xiàn)象，有人提出了一種假設(shè)：該菌體內(nèi)存在一條側(cè)系呼吸鏈，NAD(P)H經(jīng)過該呼吸鏈，可以正常的傳遞H+，將其氧化為H2O，但是并沒有氧化磷酸化生成ATP，能夠正常產(chǎn)生ATP的呼吸鏈稱之為標(biāo)準(zhǔn)呼吸鏈。當(dāng)前第50頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)解偶聯(lián)劑（uncoupler）?使氧化和磷酸化脫偶聯(lián)，氧化仍可以進(jìn)行，而磷酸化不能進(jìn)行，解偶聯(lián)劑為離子載體或通道，能增大線粒體內(nèi)膜對H+的通透性，消除H+梯度，因而無ATP生成，使氧化釋放出來的能量全部以熱的形式散發(fā)。動(dòng)物棕色脂肪組織和肌肉線粒體中有獨(dú)特的解偶聯(lián)蛋白(uncouplingproteins，UCPs)，與維持體溫有關(guān)。常用解偶聯(lián)劑主要有：質(zhì)子載體：2，4-二硝基酚(DNP，圖)，羰基-氰-對-三氟甲氧基苯肼(FCCP)。質(zhì)子通道：增溫素（thermogenin）。其它離子載體：如纈氨霉素。某些藥物：如過量的阿斯匹林也使氧化磷酸化部分解偶聯(lián)，從而使體溫升高。當(dāng)前第51頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)實(shí)驗(yàn)證明，在某些微生物體內(nèi)確實(shí)存在側(cè)系呼吸鏈，該側(cè)系呼吸鏈中的酶系強(qiáng)烈需氧，如在檸檬酸的發(fā)酵中，發(fā)酵液的溶氧濃度在很低水平維持一段時(shí)間，或中斷供氧一段時(shí)間（20分鐘），則這一側(cè)系呼吸鏈不可逆的失活，其結(jié)果是菌體不再產(chǎn)酸，而是產(chǎn)生了大量的菌體。標(biāo)準(zhǔn)呼吸鏈的存在使得菌體在代謝過程中產(chǎn)生了大量的ATP，用于菌體自身的生長上，這種現(xiàn)象，在生產(chǎn)上通常稱之為：只長菌不產(chǎn)酸，大量的葡萄糖被消耗了，卻沒有生產(chǎn)出檸檬酸，是一種失敗，（大型檸檬酸生產(chǎn)企業(yè)需要自己備用的發(fā)電系統(tǒng)）。當(dāng)前第52頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)

理論可以指導(dǎo)實(shí)踐，反過來，通過實(shí)踐可以推動(dòng)理論研究，豐富理論研究成果?？茖W(xué)研究過程中的許多基本規(guī)律是相同的，今天，我們在大學(xué)的學(xué)習(xí)，更多的是學(xué)習(xí)一種方法或者說一種思維。通過這個(gè)例子，我們可以學(xué)習(xí)到許多專業(yè)以外的知識(shí)……首先為了解釋一種客觀想象，提出一種假設(shè)，然后通過實(shí)驗(yàn)來證明這種假設(shè)……當(dāng)前第53頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)能量平衡EMP中底物水平磷酸化2ATPEMP途徑2NADH丙酮酸氧化脫羧2NADH可以滿足生產(chǎn)菌的維持能量消耗，不需要消耗C源經(jīng)TCA來產(chǎn)能當(dāng)前第54頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)CO2固定反應(yīng)通過CO2固定反應(yīng)提供C4二羧酸（1）磷酸烯醇式丙酮酸+CO2==草酰乙酸（C4二羧酸）酶：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（2）丙酮酸+CO2===草酰乙酸（C4二羧酸）酶：丙酮酸羧化酶以上兩種CO2固定反應(yīng)所需要的輔酶都是生物素。當(dāng)前第55頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)檸檬酸發(fā)酵中，三個(gè)控制點(diǎn)C6H12O6控制Mn+NH4+濃度，解除檸檬酸對PFK的抑制（1）點(diǎn)：EMP暢通無阻控制溶氧，防止側(cè)系呼吸鏈?zhǔn)Щ畋?丙酮酸（2）點(diǎn)：通過CO2固定反應(yīng)生成C4二羧酸乙酰輔酶A+C4二羧酸

檸檬酸（3）點(diǎn)：檸檬酸后述的酶活性喪失或很低，控制培養(yǎng)基中的Fe2+

的濃度檸檬酸發(fā)酵中，三個(gè)控制點(diǎn)當(dāng)前第56頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)第一個(gè)調(diào)節(jié)酶是磷酸果糖激酶（PFK）Δ

檸檬酸和ATP對該酶有抑制生產(chǎn)菌需要解除該抑制作用AMP、無機(jī)磷以及NH4+對該酶有活化作用NH4+有效解除檸檬酸和ATP對該酶有抑制，故生產(chǎn)上通過添加銨鹽來提高檸檬酸產(chǎn)量ΔMn2+的影響：Mn2+缺乏菌體的TCA酶活下降Mn2+缺乏可能干擾蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解NH4+水平升高減少檸檬酸對該酶的抑制當(dāng)前第57頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)第二個(gè)調(diào)節(jié)點(diǎn)：CO2固定的酶活力高，保證草酰乙酸的供應(yīng)第三個(gè)調(diào)節(jié)點(diǎn)：TCA環(huán)上調(diào)節(jié)檸檬酸合成酶：

許多細(xì)胞中該酶是TCA的調(diào)節(jié)酶，但在黑曲霉中此酶無調(diào)節(jié)作用順烏頭酸水合酶：理論上此酶失活TCA環(huán)阻斷積累檸檬酸順烏頭酸水合酶需要Fe2+故在發(fā)酵液中添加黃血鹽絡(luò)合Fe2+阻斷TCA環(huán)，積累檸檬酸當(dāng)前第58頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)為什么在A.nigar中異檸檬酸不會(huì)進(jìn)一步分解及檸檬酸的積累機(jī)制？黑曲霉烏頭酸水合酶存在于線粒體中，它催化的反應(yīng)存在著檸檬酸：異檸檬酸：順式烏頭酸=90：7：3的平衡關(guān)系；黑曲霉對輔酶NAD+專一性的異檸檬酸脫氫酶活力很低，卻有三種依賴于輔酶NADP+的異檸檬酸脫氫酶，其中的兩種與存在于線粒體的酶及TCA循環(huán)有關(guān)，它們受到生理濃度檸檬酸的抑制。當(dāng)前第59頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)檸檬酸生物合成途徑

當(dāng)前第60頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)檸檬酸的積累機(jī)制總結(jié)1)由于Mn2＋缺乏抑制了蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)NH4＋濃度升高和有一條呼吸活力強(qiáng)的不產(chǎn)生ATP的側(cè)系呼吸鏈，這兩方面的原因分別解除了對磷酸果糖激酶（PFK）的抑制，促進(jìn)了EMP途徑的暢通；2)由于丙酮酸羧化酶是組成型酶，不被調(diào)節(jié)控制，就源源不斷地提供草酰乙酸（CO2固定）。丙酮酸氧化脫酸生成乙酰-CoA和CO2固定兩個(gè)反應(yīng)的平衡，以及檸檬酸合成酶不被調(diào)節(jié)，增強(qiáng)了合成檸檬酸能力。當(dāng)前第61頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)檸檬酸的積累機(jī)制總結(jié)3)順烏頭酸水合酶在催化時(shí)建立以下平衡：檸檬酸∶順烏頭酸∶異檸檬酸＝90∶3∶7；4)控制Fe2+含量，順烏頭酸酶活力低，使檸檬酸積累；5)一旦檸檬酸濃度升高到某一水平就抑制異檸檬酸脫氫酶活力，從而進(jìn)一步促進(jìn)了檸檬酸自身積累；6)檸檬酸積累使pH值降低，在低pH值下，順烏頭酸酶和異檸檬酸脫氫酶失活，就更有利于檸檬酸的積累并排出體外。當(dāng)前第62頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)檸檬酸積累的理想條件：1、提高磷酸果糖激酶的活性2、提高丙酮酸羧化酶的活性3、提高檸檬酸合成酶的活性4、抑制順烏頭酸酶的活性5、抑制異檸檬酸脫氫酶的活性6、抑制-酮戊二酸脫氫酶的活性7、抑制異檸檬酸裂解酶的活性當(dāng)前第63頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)檸檬酸發(fā)酵需要下述環(huán)境條件(1)磷酸鹽濃度低；(2)氮源用NH4+鹽；(3)pH值低（<3.0）；(4)溶氧量高；(5)Mn2+、Fe2+、Zn2+含量極低。當(dāng)前第64頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)檸檬酸發(fā)酵的產(chǎn)率1.無CO2固定反應(yīng)的產(chǎn)率

192/(180×1.5)==71.1%2.通過CO2固定反應(yīng)提供C4二羧酸（無碳原子損失）

192/180==106.6%C6H12O6C6H8O7(C沒有增加)

可見，CO2固定反應(yīng)與檸檬酸發(fā)酵的重要性

C6H8O7H2O理論轉(zhuǎn)化率：116.7%當(dāng)前第65頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)檸檬酸發(fā)酵一、菌種：產(chǎn)生檸檬酸的菌種很多，以霉菌為主，又以黑曲霉產(chǎn)生檸檬酸的能力較強(qiáng)，并能利用多種碳源，故常是生產(chǎn)上使用的菌種。二、發(fā)酵機(jī)理：細(xì)胞內(nèi)有三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán)；檸檬酸合成酶活力較高，而烏頭酸酶或異檸檬酸脫氫酶可被某些因素，如金屬離子的缺乏，受到抑制，這有利于檸檬酸的積累。當(dāng)前第66頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)檸檬酸發(fā)酵三、工藝流程：①發(fā)酵液的pH值對檸檬酸生成影響很大；pH2~3時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物主要是檸檬酸；pH值中性或堿性時(shí)，會(huì)產(chǎn)生較多草酸和葡萄糖酸；②可往培養(yǎng)基中加入亞鐵氰化鉀或采取育種手段改造菌種，使烏頭酸酶或異檸檬酸脫氫酶缺失或盡量降低活性，以阻礙TCA循環(huán)的正常進(jìn)行，從而增加檸檬酸的積累。當(dāng)前第67頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)四、檸檬酸發(fā)酵用原料

檸檬酸發(fā)酵的原料有三大類糖質(zhì)原料(甘蔗廢糖蜜、甜菜廢糖蜜)、淀粉質(zhì)原料(主要是番薯、馬鈴薯、木薯等)正烷烴類原料。

當(dāng)前第68頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)營養(yǎng)物濃度對發(fā)酵的影響對生成量和組成都有影響黑曲霉檸檬酸發(fā)酵蔗糖濃度15%~18%，蔗糖同化率97%蔗糖濃度20%，只同化92%蔗糖濃度低于10%，產(chǎn)檸檬酸少，積累草酸蔗糖濃度低于2.5%，不產(chǎn)檸檬酸當(dāng)前第69頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)五、檸檬酸發(fā)酵工藝

1)

試管斜面菌種培養(yǎng)

察氏瓊脂培養(yǎng)基：NaNO3

3g，

蔗糖20g，

K2HPO4

1g，

KCl

0.5g，

MgSO4.7

H2O

0.5g，

FeSO4

0.01g，

瓊脂20g，

用水定溶至1000ml，

pH自然。

察氏-多氏瓊脂培養(yǎng)基：蔗糖30g，NaNO3

2g，

MgSO4.7H2O

0.5g，

KH2PO4

1g，

KCl

0.5g，

FeSO4.7H2O

0.01g，

溴甲分綠0.4g，瓊脂20g，

蒸餾水1000ml，

pH自然。當(dāng)前第70頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)1)

試管斜面菌種培養(yǎng)

蔗糖合成瓊脂培養(yǎng)基：蔗糖140g，

NH4NO3

2g，

KH2PO4

2g，

MgSO4.7H2O

0.25g，

FeCl3.6H2O

0.02g，

MnSO4.4H2O

0.02g，

麥芽汁20ml，

瓊脂20g，

用水定溶至1000ml。

米曲汁瓊脂培養(yǎng)基：一份米曲加四倍質(zhì)量的水，于55℃保溫糖化3~4小時(shí)后煮沸，濾液用水調(diào)整濃度至10‘Bx，并用堿液將pH調(diào)制到6.0，接著添加瓊脂2%。確認(rèn)所制成的斜面無雜菌污染后，接入黑曲霉孢子懸液0.1ml，于32℃培養(yǎng)4~5d。當(dāng)前第71頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)2)

種子擴(kuò)大培養(yǎng)

①

二級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)a

培養(yǎng)基

有瓊脂固體培養(yǎng)和液體表面培養(yǎng)兩種方法，前者的培養(yǎng)基組成與斜面培養(yǎng)基相同，后者的組成如下：麥芽汁7?BX，氯化銨2%，尿素0.1%，

當(dāng)前第72頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)2)

種子擴(kuò)大培養(yǎng)

①

二級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)b

培養(yǎng)

固體培養(yǎng)時(shí)，500ml茄子瓶裝80ml瓊脂培養(yǎng)基，250ml茄子瓶裝50ml瓊脂培養(yǎng)基。滅菌后擺成斜面，凝固后的斜面至37℃下培養(yǎng)24h。確認(rèn)無雜菌污染即可使用。

液體培養(yǎng)時(shí)，將液體培養(yǎng)基裝入三角瓶中，使液層深度達(dá)45cm，于0.1MPa下濕熱滅菌15min。按無菌操作接種。培養(yǎng)溫度32℃。液體表面需7~10d，瓊脂固體培養(yǎng)需6~7d。當(dāng)前第73頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)②

三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)可采用麩曲固體培養(yǎng)、液體表面培養(yǎng)或瓊脂固體培養(yǎng)。

所用培養(yǎng)基如下：

a

麩曲培養(yǎng)基：

新鮮小麥麩皮1kg，加水1.1~1.3L。液體培養(yǎng)基與第二級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)基所用液體培養(yǎng)基相同。

b瓊脂固體培養(yǎng)基：

與斜面培養(yǎng)基相同。當(dāng)前第74頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)現(xiàn)代工業(yè)化大生產(chǎn)主要采用深層通風(fēng)發(fā)酵法。日本約1／5的檸檬酸產(chǎn)品是利用固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)的，淺盤發(fā)酵法在前蘇聯(lián)、印度、捷克．波蘭、保加利亞、阿根廷等國家主要使用，我國、美國及西歐共同體國家則主要采用液體深層發(fā)酵法進(jìn)行生產(chǎn)當(dāng)前第75頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)3）

發(fā)酵生產(chǎn)

①

工藝流程

當(dāng)前第76頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)以薯干粉為原料的液體深層發(fā)酵工藝流程：

斜面菌種→麩曲瓶→種子

↓

薯干粉→調(diào)漿→滅菌(間歇或連續(xù)式)→冷卻→發(fā)酵→發(fā)酵液→提取→成品

↑

無菌空氣

薯渣為原料的固體發(fā)酵工藝流程：

試管斜面→三角瓶菌種→種曲

↓

薯渣→粉碎→蒸煮→攤涼接種→裝盤→發(fā)酵→出曲→提取→成品

↑

米糠

3）

發(fā)酵生產(chǎn)

①

工藝流程

當(dāng)前第77頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)②

檸檬酸的深層液體發(fā)酵工藝薯干原料檸檬酸深層發(fā)酵工藝米曲汁斜面

茄子瓶種子罐菌絲培養(yǎng)（也可以孢子接種）發(fā)酵培養(yǎng)（32℃，5～5.5天）成熟的發(fā)酵液（或10～20麥芽汁＋0.1%KH2PO4）16％的薯干粉，α-淀粉酶液化當(dāng)前第78頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)②

液體發(fā)酵

a不置換法培養(yǎng)液一次加入，發(fā)酵結(jié)束后棄去菌蓋，發(fā)酵液用來提取檸檬酸。當(dāng)前第79頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)具體操作：接種后，培養(yǎng)溫度維持在35℃，這是黑曲霉的適宜生長溫度，需維持72h左右，以促進(jìn)孢子發(fā)芽及菌體發(fā)育。當(dāng)溫度逐漸下降時(shí)，必須通人約50℃的空氣以維持35℃的培養(yǎng)溫度，通風(fēng)量為3~5m3/m2.h。接種后20h左右可出現(xiàn)灰白色、很薄的菌膜，72h時(shí)菌膜已完全形成，菌膜相當(dāng)厚且有皺褶。48h起由于菌體耗氧增加，可開動(dòng)另一組風(fēng)管向盤層之間通汽，進(jìn)汽溫度為40℃左右，風(fēng)量為7m3/m2.h，進(jìn)汽濕度為75%以上，以防培養(yǎng)液水分蒸發(fā)過快。當(dāng)前第80頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)接種后72h起進(jìn)入產(chǎn)酸期，這時(shí)菌體代謝速率高，耗糖快，發(fā)酵液酸度急劇升高，并釋放出大量熱，最高時(shí)可達(dá)1000kJ/(m2.h)，此時(shí)應(yīng)加強(qiáng)通風(fēng)措施，嚴(yán)格將發(fā)酵溫度控制在26~28℃，以利檸檬酸的形成。因此，一般在進(jìn)入產(chǎn)酸期前8h左右需增大風(fēng)量至15~18m3/m2.h，且降低進(jìn)汽溫度在25℃以下，濕度仍在75%以上。160h以后發(fā)酵結(jié)束。當(dāng)前第81頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)b

置換法置換法一般是采用糖濃度低而營養(yǎng)較豐富的培養(yǎng)液先培養(yǎng)菌蓋，待菌蓋形成之后再更換發(fā)酵培養(yǎng)基?？筛鼡Q1次也可數(shù)次，發(fā)酵液用來提取檸檬酸。當(dāng)前第82頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)培養(yǎng)菌蓋，一般使用5%的糖液，視糖蜜質(zhì)量再補(bǔ)充少量NH4NO3、K2HPO4等鹽類。接種孢子后，室溫保持在34~36℃，培養(yǎng)液品溫為32~34℃，使孢子發(fā)芽，正常情況下40h即可形成緊密有皺的菌蓋。菌蓋形成后，放掉培養(yǎng)基，更換發(fā)酵培養(yǎng)基(即第1次置換)，并將室溫降至30~32℃，待發(fā)酵48~60h后再放掉發(fā)酵液，加入新培養(yǎng)液即進(jìn)行第2次置換。如此重復(fù)，一般可置換培養(yǎng)基8~10次，總發(fā)酵周期為14~20d，收集起來的發(fā)酵液，用來提取檸檬酸。當(dāng)前第83頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)置換法的優(yōu)點(diǎn)是節(jié)省了大量培菌時(shí)間，發(fā)酵速度快，而且原本不適宜長菌的原料都可用作發(fā)酵培養(yǎng)基。但為了保持菌蓋的高活性，不能將發(fā)酵液殘?zhí)强刂频煤艿?，這樣一來就造成替換出來的發(fā)酵液其殘?zhí)橇枯^高，給后道提取檸檬酸帶來困難。當(dāng)前第84頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)c

不置換法影響表面發(fā)酵的因素a)

培養(yǎng)液層厚度

培養(yǎng)基液層厚度大，發(fā)酵產(chǎn)物總的生成量就大。如果原料質(zhì)量好，預(yù)處理方法得當(dāng)，曲霉菌絲體活力強(qiáng)，那末可適當(dāng)增加液層厚度;相反，就應(yīng)減少液層厚度。當(dāng)前第85頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)c

不置換法影響表面發(fā)酵的因素b)

糖濃度

用于表面發(fā)酵的糖蜜濃度，質(zhì)優(yōu)的糖蜜濃度(以蔗糖濃度計(jì))為18%~22%較適宜，而質(zhì)劣的糖蜜一般采用14%。在表面發(fā)酵中，大約80%的糖被用于合成檸檬酸，菌體生長增殖耗糖8%左右，菌體進(jìn)行呼吸消耗的糖在10%左右，另有1%~2%的糖用于合成副產(chǎn)物。當(dāng)前第86頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)c)

溫度黑曲霉生長最適溫度33-37℃，積累檸檬酸的最適溫度在32℃黑曲霉適宜產(chǎn)酸溫度是26~28℃。溫度高，容易形成雜酸等副產(chǎn)物且菌體易衰老；溫度低，發(fā)酵周期被延長。當(dāng)前第87頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)d)

pH值

黑曲霉長菌的最適pH為中性，而產(chǎn)酸的最適pH在2.5~2.0。因此，應(yīng)該注意的是：菌蓋形成之后，只是在菌蓋下面有一個(gè)低pH區(qū)域，菌體合成檸檬酸的活動(dòng)都是在這低pH區(qū)域內(nèi)進(jìn)行的，所以不應(yīng)該攪動(dòng)發(fā)酵液，避免低值區(qū)域的pH值上升而長菌不產(chǎn)酸。當(dāng)前第88頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)黑曲霉發(fā)酵檸檬酸，pH3.0以下積累檸檬酸，pH3.0以上積累草酸，pH5.0容易積累葡萄糖酸與不同碳源有關(guān)，黑曲霉在合成培養(yǎng)基上產(chǎn)檸檬酸pH2.5，在糖蜜上6.8，在薯干粉4.5當(dāng)前第89頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)e)

通風(fēng)

表面發(fā)酵是氣相傳氧，因此傳氧效率較高，所以只要保持發(fā)酵室內(nèi)有適當(dāng)空氣流通就可以滿足霉菌對氧的需要。較高度的CO2會(huì)影響菌體的生長和降低產(chǎn)酸能力。一般將CO2控制在3%以下。當(dāng)前第90頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)當(dāng)前第91頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)③

固體發(fā)酵

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淺盤發(fā)酵當(dāng)前第92頁\共有105頁\編于星期三\22點(diǎn)將曲置于曲室內(nèi)培養(yǎng)，室溫可按需要調(diào)節(jié)。在孢子發(fā)芽和菌絲生長期，由于產(chǎn)生的熱量少，品溫會(huì)逐漸下降，在入室后自18h內(nèi)，應(yīng)維持品溫在27~31℃。培養(yǎng)18~48h期間，由于發(fā)酵熱的大量釋放，品溫上升很快，應(yīng)采取措施，不得讓品溫超過43℃菌體活力下降，所以品溫會(huì)下降，此時(shí)應(yīng)維持在35℃左右，直至發(fā)酵結(jié)束。③

固體發(fā)酵

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淺盤發(fā)酵當(dāng)前第93頁\共有105頁\編于星期三\