實(shí)驗(yàn)一質(zhì)粒DNA的提取及檢測

實(shí)驗(yàn)一質(zhì)粒DNA的提取及檢測演示文稿當(dāng)前第1頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)質(zhì)粒（plasmid）是染色體外小型（1-200kb）的共價(jià)、閉合、環(huán)狀的雙鏈DNA分子（cccDNA），能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳的遺傳因子。常常編碼一些對宿主有利的酶的基因，這些基因的表型包括抗生素抗性、產(chǎn)生抗生素、限制酶、修飾酶等質(zhì)粒的復(fù)制：嚴(yán)緊型復(fù)制（1~n個(gè)）松弛型復(fù)制（20個(gè)以上）當(dāng)前第2頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)常用的質(zhì)粒載體是通過DNA重組技術(shù)構(gòu)建而成的。pUC18,pUC19當(dāng)前第3頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)質(zhì)粒提取的思路質(zhì)粒的特性：共價(jià)、閉合、環(huán)狀的小分子量DNA要去除的物質(zhì)：蛋白基因組DNA脂類及小分子雜質(zhì)RNA當(dāng)前第4頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)第一部分質(zhì)粒DNA的提取當(dāng)前第5頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)一．目的了解提取質(zhì)粒的原理。學(xué)習(xí)和掌握質(zhì)粒提取的方法和技術(shù)。細(xì)菌的生長和質(zhì)粒的擴(kuò)增菌體的收集裂解及質(zhì)粒DNA的分離質(zhì)粒DNA的純化當(dāng)前第6頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)二．原理堿變性法提取主要是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異：在堿性環(huán)境中，線性的大分子量細(xì)菌染色體DNA變性，而共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒DNA仍為自然狀態(tài)；將pH調(diào)至中性并有高濃度鹽存在的條件下，染色體DNA之間交聯(lián)形成不溶性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，大部分DNA和蛋白質(zhì)在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質(zhì)粒DNA仍為可溶狀態(tài)。通過離心可除去大部分細(xì)胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質(zhì)，質(zhì)粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA（可省略）。當(dāng)前第7頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)☆原理示意圖返回目錄

返回原理當(dāng)前第8頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑

（一）儀器：恒溫?fù)u床、臺式離心機(jī)、高壓滅菌鍋（二）材料：含pUC18（或其他）質(zhì)粒的大腸桿菌、（三）試劑： LB培養(yǎng)基（液體、固體）

溶液I

溶液II

溶液III

TE(pH8.0)當(dāng)前第9頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)溶液I50mmol/L葡萄糖/1mg/mL溶菌酶25mmol/LTris·Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)在10lbf/in2(6.895×104Pa)高壓下蒸汽滅菌15分鐘，保存于4℃。

作用：裂解細(xì)胞，鰲合金屬離子使金屬酶失活當(dāng)前第10頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)溶液II0.2mol/LNaOH(從5mol/L貯存液中現(xiàn)用稀釋)1%SDS作用：細(xì)胞壁肽聚糖在堿性下水解，核酸和蛋白質(zhì)變性。當(dāng)前第11頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)溶液III5mol/L乙酸鉀 60ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml所配成的溶液中鉀的濃度為3mol/L，乙酸根的濃度為5mol/L。作用：酸性條件下質(zhì)粒DNA復(fù)性，變性蛋白-SDS＋線性DNA沉淀，K＋可中和DNA當(dāng)前第12頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)TE(pH8.0)10mmol/LTris·Cl(pH8.0)

1mmol/LEDTA(pH8.0)RNA酶（降解RNA）作用：穩(wěn)定ＤＮＡ

當(dāng)前第13頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)特點(diǎn)：小量質(zhì)粒制備、最簡便、快捷應(yīng)用：質(zhì)粒酶切鑒定、克?。ù痔幔y序、轉(zhuǎn)染（細(xì)提）質(zhì)粒提取試劑盒常用方法：小量堿裂解法滿足不同需要的試劑盒純化原理：離子交換柱層析等小量制備質(zhì)粒kit大量制備質(zhì)粒kit去除內(nèi)毒素制備質(zhì)粒kit可用于大部分分生實(shí)驗(yàn)當(dāng)前第14頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)

四、實(shí)驗(yàn)步驟接含pUC18(或pET21a)質(zhì)粒的單菌落于3mlLBAmp+液體培養(yǎng)基中370C，190rpm振蕩培養(yǎng)過夜取1.5ml菌液入1.5ml的離心管中6000rpm、離心2min，棄上清，收集菌體100uL溶液I懸浮菌體（充分振蕩），室溫10min加入200uL溶液II（輕輕混勻），冰上靜置5min裂解菌體當(dāng)前第15頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)加入150uL溶液III（輕輕混勻），冰上靜置15min質(zhì)粒DNA復(fù)性12000rpm，離心15min，取上清記錄體積到一新管上清加等體積的酚：氯仿（振蕩混勻）12000rpm，離心15min，取上清記錄體積到一新管當(dāng)前第16頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)上清加2倍體積的無水乙醇（充分混勻），冰浴30min12000rpm，離心15min沉淀用75%乙醇1mL洗滌兩次（輕彈混勻、離心）12000rpm，離心10min晾干沉淀沉淀用20ulTE溶解沉淀法當(dāng)前第17頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)吸附管用BL500ul平衡取上清加入吸附管5000rpm離心5min加PW漂洗液500ul，放置2min10000rpm離心5min，晾干加30ulTE，10000rpm離心5min（收集到干凈的EP管中）吸附法當(dāng)前第18頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)第二部分瓊脂糖凝膠電泳當(dāng)前第19頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)

相關(guān)知識電泳：泳動速度決定于？瓊脂糖凝膠天然瓊脂（Agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（Agarose，約占80％）及瓊脂膠（Agaropectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷。而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強(qiáng)酸性多糖，由于這些基團(tuán)帶有電荷，在電場作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果。瓊脂糖透明無紫外吸收，因此，目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳。當(dāng)前第20頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)瓊脂糖凝膠濃度與線性DNA分辨范圍

當(dāng)前第21頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系

不同構(gòu)型DNA的移動速度依次為：共價(jià)閉環(huán)超螺旋DNA（cccDNA）＞直線DNA（LDNA，2條鏈發(fā)生斷裂）＞開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA（ocDNA，1條鏈發(fā)生斷裂）。

當(dāng)前第22頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)影響遷移率的因素DNA分子的大小、瓊脂糖凝膠的濃度、DNA的構(gòu)象、所加電壓（一般5V/cm）、電場方向、嵌入染料的存在、電泳緩沖液的組成等。當(dāng)前第23頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

通過本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技術(shù)。當(dāng)前第24頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)二、實(shí)驗(yàn)原理

DNA在瓊脂糖凝膠中泳動時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。核酸為兩性分子，在pH3.5時(shí)，整個(gè)分子帶正電,pH8左右時(shí)，堿基幾乎不解離，整個(gè)分子帶負(fù)電。在堿性環(huán)境下，相同堿基數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈負(fù)電荷，能以同樣的速度向正極方向移動。具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動速度不一樣，可進(jìn)行分離。DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系，可以近似用于估算分子的大小。可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子。共價(jià)閉環(huán)超螺旋DNA（cccDNA）＞直線DNA（LDNA，2條鏈發(fā)生斷裂）＞開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA（ocDNA，1條鏈發(fā)生斷裂）。

當(dāng)前第25頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)質(zhì)粒的電泳質(zhì)粒DNA的3種形式泳動速度:超螺旋>線性>開環(huán)

質(zhì)粒DNA的存在形式有3種:1、共價(jià)閉環(huán)DNA:常以超螺旋形式存在2、開環(huán)DNA:質(zhì)粒DNA兩條鏈中有一條發(fā)生一處或多處斷裂，因此可以自由旋轉(zhuǎn)從而消除張力,形成松弛的環(huán)狀分子

3、線性DNA:因質(zhì)粒DNA的兩條鏈在同一處斷裂而造成.開環(huán)超螺旋線性當(dāng)前第26頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)三、儀器、材料與試劑

（一）儀器：穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀（二）材料1.自已提取的質(zhì)粒DNA2.相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品（三）試劑1．5×TBE儲液(pH8.0)使用時(shí)稀釋10倍，成1×TBE。2．凝膠加樣緩沖液（loadingbuffer）3.1%瓊脂糖4.10mg/ml溴化乙錠溶液（EB），4℃保存。用時(shí)稀釋成

5ug/ml的EB。當(dāng)前第27頁\共有30頁\編于星期三\22點(diǎn)四．操作步驟瓊脂糖（1%）凝膠電泳稱取一定量瓊脂糖凝膠，按1g中100ml的量加入電泳緩沖液，微波爐中加熱約2min，使瓊脂糖溶解；溶液冷至60℃，加入EB至終濃度為0.5μg/ml，混勻，注意戴手套操作；將瓊脂糖倒入電泳板中，使凝膠厚度約為，迅速插上梳子，檢查有無氣泡；待凝膠完全凝固后（約30min），小心取出梳子，將凝膠板置于電泳槽中，加入電泳buffer，讓液面高出膠面1mm；在DNA樣品（20ul）中加入6×loadingbuffer（4ul），混勻后用移液槍將樣品加入樣品孔中電泳，電壓100V；根據(jù)指示劑的位置，判斷是否終止電泳;在紫外燈下／凝膠成像儀上觀察電泳結(jié)果。當(dāng)前第28頁\共有30頁\編于