實驗一培養(yǎng)基的制備消毒滅菌及油鏡的使用

實驗室安全和衛(wèi)生安全實驗室嚴禁吸煙。注意用水、防電和防火正確使用化學試劑和儀器衛(wèi)生每次實驗需留下6位同學值日，協(xié)助保持實驗室清潔當前第1頁\共有31頁\編于星期三\22點1、了解培養(yǎng)基的概念、種類和用途，明確培養(yǎng)基的配制原理。2、學習掌握培養(yǎng)基配制的一般方法和步驟。3、掌握高壓蒸汽滅菌的原理和方法步驟。實驗目的一培養(yǎng)基的配制當前第2頁\共有31頁\編于星期三\22點

培養(yǎng)基(culturemedium)——是指人工配制的、適合微生物生長繁殖或積累代謝產物的營養(yǎng)基質。自然界中微生物種類繁多，營養(yǎng)類型多樣，加之實驗和研究目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多，不同種類的培養(yǎng)基一般都應含有微生物生長所需的碳源、氮源、能源、無機鹽、生長因子和水六大營養(yǎng)要素，且各成分比例應合適。為了滿足微生物生長繁殖或積累代謝產物的要求，還必須控制培養(yǎng)基合適的pH。實驗原理當前第3頁\共有31頁\編于星期三\22點常用凝固劑是瓊脂，固體培養(yǎng)基瓊脂加量通常為1.5%-2%；半固體培養(yǎng)基瓊脂加量為0.5%-0.8%。實驗原理(continued)常用培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基廣泛用于細菌的培養(yǎng)；高氏一號培養(yǎng)基用于培養(yǎng)放線菌；麥芽汁培養(yǎng)基和豆芽汁培養(yǎng)基通常用于酵母菌的培養(yǎng)；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基被廣泛用于培養(yǎng)霉菌。當前第4頁\共有31頁\編于星期三\22點牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方：牛肉膏3g蛋白胨10gNaCl5g瓊脂15-20g水1000ml5-6人一組，每組500ml斜面2支（每人），余裝三角瓶

當前第5頁\共有31頁\編于星期三\22點1、稱量及溶化2、調pH3、加瓊脂、溶化、定容、（過濾）4、分裝（每人2只試管）、加塞、包扎5、滅菌6、擺斜面操作步驟當前第6頁\共有31頁\編于星期三\22點稱量與溶化：注意：1）牛肉膏的稱?。河貌ＡО粽喝∵m量牛肉膏，抹于稱量紙上，勿取過量，不足時，再蘸取少量，逐步添加；然后將牛肉膏連同稱量紙放入水中，稍等片刻牛肉膏即從稱量紙上脫落，用玻璃棒將紙撈出即可。操作步驟(continued)當前第7頁\共有31頁\編于星期三\22點加瓊脂、溶化、定容、（過濾）瓊脂一般應在調好了pH后加入，瓊脂的加入不會影響培養(yǎng)基的pH。瓊脂加入后應煮沸數分鐘，以使其完全溶化，否則易出現分布不均，導致部分斜面不凝固或過軟，另外部分則瓊脂過多。加熱過程中因水分蒸發(fā)而可能使培養(yǎng)基體積減小，應補充水分至所需量。操作步驟(continued)當前第8頁\共有31頁\編于星期三\22點分裝：1）裝量：液體——試管高度的1/4左右固體——試管高度的1/5，滅菌后擺斜面半固體——一般為試管高度的1/3，滅菌后垂直放置操作步驟(continued)當前第9頁\共有31頁\編于星期三\22點分裝：2）分裝裝置：操作步驟(continued)3）注意：分裝過程中注意不要使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染；若不慎沾在了管口，可用濕紗布揩凈。當前第10頁\共有31頁\編于星期三\22點棉塞制作方法：加塞：棉塞或硅膠塞作用：防止外界微生物進入培養(yǎng)基內造成污染，并保證有良好的通氣性能。當前第11頁\共有31頁\編于星期三\22點包扎：

加塞后，試管通常每7支一起，包上一層牛皮紙或兩層報紙，用線繩扎緊。三角瓶加塞后也用牛皮紙包扎。

以活結形式扎緊，以便使用時容易解開。

用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、配制日期、配制人或實驗組。操作步驟(continued)滅菌時包牛皮紙當前第12頁\共有31頁\編于星期三\22點滅菌：

培養(yǎng)基滅菌一般采用壓力蒸汽滅菌

通常滅菌條件為1.05kg/cm2,121.3℃滅菌20分鐘；含糖量高的培養(yǎng)基，如馬丁氏培養(yǎng)基則為0.56kg/cm2,112.6℃滅菌30分鐘。

操作步驟詳見下一課件操作步驟(continued)當前第13頁\共有31頁\編于星期三\22點擺斜面：

成扎擺放，不需將每支試管單獨擺放

最好待培養(yǎng)基冷至60℃時擺斜面，以免形成大量冷凝水無菌檢查：將滅菌的培養(yǎng)基放在37℃溫箱中培養(yǎng)24-48小時，以檢查滅菌是否徹底。當前第14頁\共有31頁\編于星期三\22點二消毒與滅菌當前第15頁\共有31頁\編于星期三\22點

加熱法干熱法濕熱法火焰燒灼熱空氣滅菌壓力蒸汽滅菌間歇滅菌煮沸滅菌巴斯德消毒實驗原理1、了解掌握常用消毒、滅菌方法的原理。2、學習掌握干熱滅菌和壓力蒸汽滅菌操作步驟。實驗目的當前第16頁\共有31頁\編于星期三\22點

濾膜過濾器的濾膜是一種多孔纖維素，孔徑一般為0.45um，過濾時，液體和小分子物質通過，細菌被截流在濾膜上。過濾除菌——許多材料，如血清、糖溶液等，用一般加熱消毒滅菌方法，均會被熱破壞，應采用過濾除菌。應用最廣的過濾器有蔡氏(Seitz)過濾器和膜過濾器。當前第17頁\共有31頁\編于星期三\22點紫外線滅菌——紫外線波長在200-300nm,具有殺菌作用，其中以265-266nm殺菌力最強。無菌室或無菌接種箱空氣可用紫外線燈照射滅菌。實驗原理(continued)

當前第18頁\共有31頁\編于星期三\22點干熱滅菌電烤箱實驗內容及實驗步驟

1、干熱滅菌2、壓力蒸汽滅菌當前第19頁\共有31頁\編于星期三\22點干熱滅菌1、裝入待滅菌物品2、升溫接通電源，加熱升溫至160-170℃。3、恒溫保持160-170℃2小時。4、降溫切斷電源，自然降溫。5、開箱取物待烤箱溫度降到70℃以下以后，方可打開箱門，取出物品。箱內溫度高于70℃，切勿自行打開箱門，以免玻璃器皿炸裂。實驗內容及實驗步驟(continued)

當前第20頁\共有31頁\編于星期三\22點實驗內容及實驗步驟(continued)

壓力蒸汽滅菌當前第21頁\共有31頁\編于星期三\22點當前第22頁\共有31頁\編于星期三\22點壓力蒸汽滅菌1、檢查水位，放入物品。2、加蓋、擰緊對稱用力3、加熱升溫4、排冷空氣等壓力升至0.5kg/cm2時，打開排氣閥，排凈冷空氣。5、升溫、保壓等鍋內壓力升至所需數值（通常為1.03kg/cm2），保持壓力20-30分鐘。6、降壓、取物實驗內容及實驗步驟(continued)

當前第23頁\共有31頁\編于星期三\22點三油鏡的使用學習并掌握普通光學顯微鏡的構造和油鏡的使用技術及維護的基本知識初步認識細菌的基本形態(tài)實驗目的當前第24頁\共有31頁\編于星期三\22點實驗原理1顯微鏡的構造

1.光學部分:目鏡、物鏡、照明裝置(聚光鏡、虹彩光圈、反光鏡等)。它使檢視物放大,生成物象。2.機械部分:鏡座、鏡臂、鏡筒、物鏡轉換器、載物臺、載物臺轉移器、粗調節(jié)器、細調節(jié)器等部件.它起著支持調節(jié)固定等作用.當前第25頁\共有31頁\編于星期三\22點圖1-1-2光學顯微鏡的成像原理倒立的虛像當前第26頁\共有31頁\編于星期三\22點油鏡使用的原理油浸接物鏡。當光線由反光鏡通過玻片與鏡頭之間的空氣時，由于空氣與玻片的密度不同，使光線受到曲折，發(fā)生散射，降低了視野的照明度。若中間的介質是一層油（其折射率與玻片的相近），則幾乎不發(fā)生折射，增加了視野的進光量，從而使物象更加清晰。浸沒油與玻璃的折射率相近很多原來由于在透鏡及載片表面的反射和折射而損失的光線可以進入物鏡，使照明亮度提高，改善觀察效果。當前第27頁\共有31頁\編于星期三\22點二、顯微操作現場演示1.低倍鏡觀察：粗調、細調。依次再進行中倍、高倍觀察2.油鏡觀察：高倍鏡下找到清晰的物象后，在標本中央滴一滴香柏油，使油鏡鏡頭浸入香柏油中，細調至看清物象為止。3.換片：另換新片，必須從第1條開始操作。4.用后復原：觀察完畢，上懸鏡筒，先用擦鏡紙擦去鏡頭上的油，然后再用擦鏡紙沾取少量乙醚酒精或二甲苯擦去殘留的油，最后用擦鏡紙擦去殘留的乙醚酒精或二甲苯，后將鏡體全部復原。

注意：油鏡使用完畢后一定要用乙醚酒精或二甲苯擦拭鏡頭用油鏡觀察細菌三形永久裝片。當前第28頁\共有31頁\編于星期三\22點1.不準擅自拆卸顯微鏡的任何部件,以免損壞。2.鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度3.觀察標本時，必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當目視接目鏡時，特別在使用油鏡時，切不可使用粗調節(jié)器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。4.拿顯微鏡時，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿。5.顯微鏡應存放在陰涼干燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片。顯微鏡保養(yǎng)和使用中的注意事項當前第29頁\共有31頁\編于星期三