現(xiàn)代分離技術第二章

現(xiàn)代分離技術第二章演示文稿當前第1頁\共有54頁\編于星期四\4點現(xiàn)代分離技術第二章當前第2頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

什么是色譜方法(Chtomatography)?

最初，1903年，M.C.Цвег把干燥的葉子用石油醚萃取后，將小量的萃取液傾入充填有沉降碳酸鈣的玻璃柱子的頂端，然后用石油醚淋洗，結果葉中的色素在碳酸鈣柱上互相分離，形成不同顏色的色帶，分列在柱上；隨著淋洗液的流動，色帶的分離越加明顯。他把這種方法叫做“色譜法”，色譜的英文名稱是chromatograph，它是由希臘文chromos和grapho兩字并合而成，字面上意義是顏色的記錄。

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什么是色譜方法(Chtomatography)?當前第4頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

可以說茨維特在色譜方面做了開創(chuàng)性的工作，但以后的二十幾年并未引起很多人的注意，直到1931年有人用充填氧化鋁粉末的柱管將性質非常相似的α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素分離成功（在此之前，人們一直以為胡蘿卜素是一種純物質），并且得到的純物質可做Ｃ、Ｈ元素定量分析用，這才引起了許多有機化學工作者的注意，認識到色譜法在分離混合物方面有廣闊的前景，并且研究出許多新技術，例如分配色譜法、紙上色譜法、薄層色譜法、離子交換色譜法等。當前第5頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

現(xiàn)在，人們所說的“色譜”一詞的含義已經遠不是茨維特所發(fā)現(xiàn)的那種色帶，而是根據(jù)混合物中各組分在互不相溶的兩相(固定相、流動相)中的吸附能力、分配系數(shù)或其它親合能力的差異而設計的分離分析方法，它集分離與分析于一體，快速、簡便、微量，成為分離分析復雜混合物的理想方法之一。現(xiàn)在，色譜法所涉及到的領域不僅限于分析化學，而且涉及到許多其它領域如石油化工、精細化工、近代電子技術、生命科學、食品科學、臨床分析、考古學、甚至興奮劑檢測等。當前第6頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

雖然目前在各種色譜法中茨維特所發(fā)現(xiàn)的那種色帶已經沒有普遍性，但由于這種名稱在中外已沿用很久，眾所周知，不宜更改。因此國家標準中仍定名為色譜法。當前第7頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

色譜分離法的種類很多，根據(jù)流動相和固定相的特點，可以分為：柱色譜（ＣＣcolumuchro.）薄層色譜（ＴＬＣthinlayerchro.）紙色譜（ＰＣpaperchro.）氣相色譜（ＧＣgaschro.）高效液相色譜（ＨＰＬＣhighperformanceliquidchro.）凝膠滲透色譜（ＧＰＣgelpermeationchro.）離子交換色譜（ＩＥＣironexchangchro.）

…………

這里我們主要介紹ＴＬＣ、ＧＣ、ＨＰＬＣ。當前第8頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

一、簡介ＴＬＣ──在鋪成薄層的固體上進行色譜的方法。（簡述ＴＬＣ的操作及儀器）當前第9頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

優(yōu)點：①操作容易，設備簡單，易于掌握。②分離迅速（ＰＣ需幾個小時到幾十個小時，ＴＬＣ只需十幾分鐘到幾十分鐘）。③靈敏度高（可檢測10-5μg物質）。④固定相（與ＰＣ相比）、流動相（與ＧＣ相比）、顯色劑(與PC相比）均可靈活選用。當前第10頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

優(yōu)點：⑤樣品用量可?。◣孜⒖恕珟资⒖耍┛纱螅◣缀量恕珟装俸量耍?，可用于備色譜。⑥特別適用于熱不穩(wěn)定及難揮發(fā)樣品。⑦技術多樣化（如雙向展開、多次展開等），可分離復雜樣品。⑧不存在樣品堵塞柱子而使柱效下降或柱子報廢的問題。當前第11頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

缺點：①不適合揮發(fā)性樣品、②自動化程度低于ＧＣ、ＨＰＬＣ。③分離效果不及ＧＣ、ＨＰＬＣ，不能分離過于復雜的樣品。當前第12頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

二、基本原理1.TLC分類按照分離過程中樣品與固定相、流動相之間相互作用的性質，有三種TLC：①吸附色譜：②分配色譜：③離子交換色譜：當前第13頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

①吸附色譜：利用樣品中各組分對吸附劑（固定相）的吸附能力不同，將其分離。Ｒf值大──溶質對吸附劑的吸附能力小。Ｒf值小──溶質對吸附劑的吸附能力大。當前第14頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

②分配色譜：利用樣品中各組分對固定液與流動相的分配系數(shù)不同，將其分離，原則上與液－液連續(xù)萃取相似。Ｒf值大──溶質易溶于流動相，不易溶于固定相。Ｒf值小──溶質易溶于固定相，不易溶于流動相。當前第15頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

③離子交換色譜：樣品中某組分與離子交換劑進行離子交換作用。這里主要介紹吸附色譜。當前第16頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

2.吸附色譜原理二、基本原理

吸附色譜的原理是基于樣品溶液與固定相表面發(fā)生了吸附作用。吸附有物理吸附和化學吸附之分，物理吸附的特點是無選擇性、吸附速度快、可逆、吸附熱小，化學吸附的特點是有選擇性、吸附速度慢、不可逆、吸附熱大。在吸附色譜中主要發(fā)生物理吸附。當前第17頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

在吸附劑固體表面，溶質分子（Ａ）與溶劑分子（Ｓ）以占據(jù)吸附劑表面的位置可以互相競爭，Ａ可以頂出Ｓ，Ｓ也可以頂出Ａ，這種競爭可用下式表示：Ａ溶＋Ｓ吸＝＝Ａ吸＋nＳ溶

Ａ溶──溶液中的溶質分子；Ａ吸──被吸在吸附劑表面的溶質分子；Ｓ溶──溶液中的溶劑分子；Ｓ吸──被吸在吸附劑表面的溶劑分子；

n──競爭過程中，被溶質分子頂出來的溶劑分子的個數(shù)（假定溶質分子體積比溶劑分子大）。當前第18頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

溶質分子頂替溶劑分子時，過程從左向右進行；溶劑分子頂替溶質分子時，過程從右向左進行；一定條件下（如Ａ、Ｓ、吸附劑、Ｔ、Ｐ、…

…），這種競爭達到平衡，即Ａ、Ｓ的吸附或解吸速度相等。但條件改變時，平衡就會遭到破壞，如果向上述平衡體系中加入溶劑，平衡就會向左移動，然后達到新的平衡。當前第19頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

在吸附薄層色譜中，展開劑(溶劑)是不斷供給的。所以，原點上Ａ與Ｓ（展開劑）之間的平衡不斷遭到破壞，吸附在原點上的溶質不斷解吸，解吸出來的Ａ溶于Ｓ中并隨之向前移動，遇到新的吸附劑表面，Ａ與Ｓ又建立起新的平衡，但又立刻遭到不斷移動上來的展開劑（Ｓ）的破壞，又有一部分Ａ解吸并隨之向前移動。如此吸附－解吸附－再吸附－再解吸附－再吸附－……的交替過程就構成了色譜法的分離基礎。當前第20頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

吸附力弱的組分容易解吸而溶于展開劑中，并隨之向前移動，Rf值較大；吸附力強的組分不易解吸，也不易隨著展開劑向前移動，Ｒf值較?。蝗绻麡悠啡芤褐杏袃煞N溶質Ａ1、Ａ2，其極性不同，因而其吸附能力、Rf值也就不同，從而達到分離。當前第21頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

3.吸附作用強弱順序二、基本原理如何判斷各種溶質分子在吸附劑表面吸附能力的大小？當然是考慮吸附劑與溶質分子間作用力的大小。

吸附色譜常用的吸附劑為：氧化鋁、硅膠根據(jù)活性分為五個級，一級活性最高，五級最低。當前第22頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

O│

聚酰胺：─C-NH-(CH2)5─吸附劑的共同特點是：①含有帶孤對電子的氧原子、氯原子。②含有-NH-、-OH-等,易形成氫鍵。即極性大，易成氫鍵。當前第23頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

吸附劑與非極性溶質分子間的作用力主要是誘導力；吸附劑與極性溶質分子間的作用力主要是靜電力。（靜電力＞誘導力）所以，溶質的極性越大，與吸附劑的作用力越大，即極性大的樣品與固定相的親合力大。當前第24頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

所以，吸附劑與被吸附物質間的親合作用遵循下列原則：①被吸附物質的極性越大，與極性吸附劑的作用越強，單官能團化合物與硅膠或氧化鋁有下列親合順序：羧酸＞醇、酰胺＞伯胺＞酯、醛、酮＞腈、叔胺、硝基化合物＞醚＞烯＞鹵烷＞烷烴②分子中雙鍵數(shù)目越多，親合力越大；③分子中苯環(huán)數(shù)目越多，親合力越大；④分子中官能團數(shù)目越多，親合力越大；（有例外：鄰硝基苯酚與硅膠、氧化鋁的親合力＜苯酚或硝基苯）⑤被吸附物質的分子量越大，親合力越大（色散力大）。當前第25頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

三、儀器裝置：用以涂布薄層用的載板有玻璃板、鋁箔及塑料板當前第26頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

四、實驗技術

實驗技術包括：①吸附劑的選擇和制備；②薄板的制備；③薄板的活化；④點樣技術；⑤展開技術；⑥顯色技術。當前第27頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

1.吸附劑的選擇和制備：⑴硅膠(Silicagel):

無定形多孔物質，適用于酸性和中性物質的分離。硅膠H──不含粘合劑硅膠G──含煅石膏(gypsum)做粘合劑。有時淀粉、CMC等也可用做粘合劑。硅膠HF254──含無機螢光(fluoresent)物質，在254nm下觀察螢光。硅膠GF254──含煅石膏和無機螢光物質。當前第28頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

1.吸附劑的選擇和制備：⑵氧化鋁:

無定形多孔物質，也有氧化鋁H、氧化鋁G、氧化鋁HF、氧化鋁GF等型號，還有酸性、中性、堿性氧化鋁之分。氧化鋁一般在100-150目。

酸性氧化鋁──10%HCl浸泡過夜，水洗至pH值=4，適用于酸性物質的分離。酸性氧化鋁適用于pH4~4.5的酸性有機酸類的分離。10min

(pH=4指1gAl2O3+10ml水───→測濾液之pH值)△當前第29頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

中性氧化鋁──10％HCl浸泡過夜，水洗至pH值=7，適用于分離中性物質。中性氧化鋁適用于醛、酮、醌、酯等pH約為7.5的中性物質的分離。堿性氧化鋁──水中浸泡過夜，pH≈10,適用于分離堿性物質。堿性氧化鋁，適用于碳氫化合物、生物堿及堿性化合物的分離，一般適用于pH為9-10的環(huán)境。當前第30頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

1.吸附劑的選擇和制備：⑶聚酰胺：

由酰胺聚合而成的高分子，其分子內存在著許多酰胺基，可與酚類、酸類、醌類、硝基化合物等形成氫鍵而產生吸附作用，根據(jù)樣品中組分的結構不同（如能形成氫鍵基團的數(shù)目、位置以及雙鍵和苯環(huán)數(shù)目的多少等）與聚酰胺產生吸附作用的強弱不同，從而使樣品達到分離。O│

聚酰胺：─C-NH-(CH2)5─當前第31頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

1.吸附劑的選擇和制備：⑶聚酰胺：聚酰胺可由錦綸絲制備，也可直接購買商品薄層色譜用聚酰胺薄膜。由錦綸絲制備聚酰胺固定相有兩種方法：當前第32頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

1.吸附劑的選擇和制備：⑶聚酰胺：a.冰醋酸法：當前第33頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

1.吸附劑的選擇和制備：⑶聚酰胺：b.濃鹽酸法:當前第34頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

1.吸附劑的選擇和制備：⑷葡聚糖凝膠：

凝膠可將分子大小和形狀不同的物質分離，好象用過篩的方法把大分子與小分子分開一樣。因此凝膠又稱為凝膠分子篩。葡聚糖凝膠是一種廣泛應用的凝膠，它是由一定分子量的葡聚糖懸浮于有機相中，再加入交聯(lián)劑表氯醇使葡聚糖交聯(lián)聚合而成（可直接購買商品使用）。它適用于蛋白質、多糖等大分子物質的分離和提純?？煞蛛x的分子量范圍從幾百到幾十萬不等。當前第35頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

2.展開技術:⑴展開劑的選擇（技術關鍵，對分離效果影響最大）：根據(jù)樣品的極性，溶解度以及吸附的活性等因素來選擇展開劑。原則１：展開劑對被分離物質有一定的解吸能力（否則，不能將Ａ解吸下來，Ａ會待在原點不動），但又不能太大（否則，Ａ不被吸附，而是跟著Ｓ一起跑，達不到分離的目的）；展開劑的極性應略小于被分離物質。原則２：展開劑對被分離物質有一定的溶解度（否則，被頂出的Ａ不溶于Ｓ，就不會隨著Ｓ向前移動）。當前第36頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

2.展開技術:⑴展開劑的選擇實際操作時，可參考下列溶劑的洗脫能力順序：

硅膠板上：乙腈＞二氧六環(huán)＞丙酮＞乙酸乙酯＞乙醚＞二氯甲烷＞氯仿＞苯＞四氯化碳＞戊烷氧化鋁板上：乙酸＞甲醇＞異丙醇＞吡啶＞乙腈＞二甲亞砜＞乙酸乙酯＞二氧六環(huán)，丙酮＞二氯乙烷＞四氫呋喃＞二氯甲烷＞氯仿＞乙醚＞苯＞甲苯＞四氯化碳＞環(huán)己烷＞石油醚＞戊烷當前第37頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

2.展開技術:⑴展開劑的選擇說明:①實際工作中，某些溶劑的順序會有顛倒出入，所以以上順序只作參考。②實際工作中,更常用到二元、三元混合溶劑作展開劑，這時可參考有關資料。（例如，分離氨基酸時，可找有關氨基酸分離的資料）利用資料上報導的展開劑試驗時，往往還要經過實驗來確定合適的展開劑。當前第38頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

2.展開技術:⑵展開方式:

a.上升法:適用于硬板。b.傾斜上升法:適用于軟板。c.下降法:此法受重力影響，展開速度較快，但有時前沿不整齊。d.雙向展開:使用方形玻板，樣品點在角上，先用一種展開劑展開，將玻板轉動90°后,再用另一種展開劑展開。此法適用于較復雜的樣品。當前第39頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

3.顯色技術:⑴蒸汽顯色:碘、溴、濃氨水等，放在干燥器中;

薄板揮去展開劑，放在上述干燥器中，顯色時間與靈敏度隨化合物而異。碘遇有機物顯黃－黃棕色斑點，拿出后迅速用鉛筆畫下斑點的形狀及位置。當前第40頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

3.顯色技術:多數(shù)有機化合物吸附碘蒸氣后顯示不同程度的黃褐色斑點，這種反應有可逆及不可逆兩種情況。前者在離開碘蒸氣后，黃褐色斑點逐漸消退，并且不會改變化合物的性質，且靈敏度也很高，故是定位時常用的方法；后者是由于化合物被碘蒸氣氧化、脫氫增強了共軛體系，因此在紫外光下可以發(fā)出強烈而穩(wěn)定的熒光，對定性及定量都非常有利。當前第41頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

3.顯色技術:⑵噴霧顯色:

將顯色劑(與被分離物質有顏色反應的物質)配成溶液，裝入噴霧器中，噴灑在薄板上，必要時可用熱吹風加熱。(見教材P267表10-1及陳耀祖書P47附錄.顯色劑)當前第42頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

五、應用1.定性：

以Rf值為指標。在一定條件下，各種有機物的Ｒf值是特定的常數(shù)，但“一定的條件”不易保證（如吸附劑的活性、取樣量的大小、展開槽的飽和程度、邊緣效應、薄板的厚度、展開方式等），所以最好用標準樣品做對照。當前第43頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

五、應用1.定性：應用實例：例１用薄層色譜分離測定表面活性劑：硅膠G，碘蒸氣顯色硅膠G，碘蒸氣顯色C18反相硅膠板，碘蒸氣顯色展開劑：CH2Cl2/CH3OH(8∶1)展開劑：CH2Cl2/CH3OH/HAc(8∶1∶0.75)展開劑：C2H5/2%Na2B4O7.10H2O(8∶2)陰離子表面活性劑Rf陽離子表面活性劑Rf非離子表面活性劑Rf十二烷基硫酸鈉0.15十六烷基三甲基氯化銨0.21十二烷基酚聚氧乙烯醚0.54十二烷基苯磺酸鈉0.09十六烷基氯化吡啶0.27月桂酸鈉0.70十二烷基胺0.42乙烯加合物(n=10)0.70二辛基硫代琥珀酸鈉0.28十八烷基胺0.55壬基酚聚氧乙烯醚(n=5)0.45當前第44頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

五、應用1.定性：例２氨基酸的分離：試樣：天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、酪氨酸的混合物。吸附劑：硅膠Ｇ(厚0.25mm).展開劑：①水：乙醇：乙酸(1:5:0.1);②苯酚:水(4:1)

展開距離：10厘米(約45min)

顯色：茚三酮正丁醇溶液，110℃加熱，天冬氨酸顯紫色，其余均顯桃紅色。

根據(jù)此法可設計豬皮、羊皮、牛皮中各種氨基酸含量的分析方法。當前第45頁\共有54頁\編于星期四\4點第二章薄層色譜

五、應用1.定性：ＴＬＣ在定性方面的應用，除了鑒定示知物以外，還有下列用途①檢驗藥物的純度及其中的雜質。將藥樣溶液點在薄板上，經展開后，應只出現(xiàn)一個與標準樣品位置一致的斑點，若試樣出現(xiàn)另外的斑點，即表明其中有雜質存在。若事先測也顯色劑對雜質的取小檢出量，則可用薄層色譜法做雜質的限量檢查。例如，若最小檢出量為0.5μg,在薄層上點樣100μg后,不出現(xiàn)雜質的斑點，即說明試樣的純度不低于9