慢性活動(dòng)性乙型肝炎外周血T細(xì)胞亞群上活化抗原的表達(dá)

慢性活動(dòng)性乙型肝炎外周血T細(xì)胞亞群上活化抗原的表達(dá)

關(guān)鍵詞：慢性;乙型肝炎;T淋巴細(xì)胞;CD69;HLA-DR

摘要:目的探討慢性活動(dòng)性乙型肝炎患者外周血活化抗原CD69、HLA-DR分子在T細(xì)胞表達(dá)的變化及其意義。方法以31例正常人作為對(duì)照，采用免疫熒光三色標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)30例CAHB患者外周血T細(xì)胞亞群及其CD69、HLA-DR抗原表達(dá);同時(shí)用熒光定量PCR檢測(cè)患者的病毒DNA載量。結(jié)果CAHB患者外周血CD3+T細(xì)胞的百分率與正常對(duì)照組比較差異有顯著性，CD4+T細(xì)胞的百分率明顯低于正常對(duì)照組，CD8+T細(xì)胞的百分率明顯高于正常對(duì)照組;CD3+T細(xì)胞CD69的表達(dá)與正常人對(duì)照組比較差異也有顯著性，其中CD4+T細(xì)胞CD69的表達(dá)與正常對(duì)照組比較差異無顯著，CD8+T細(xì)胞表達(dá)CD69水平明顯高于對(duì)照組;CD3+T細(xì)胞上HLA-DR的表達(dá)與正常對(duì)照組之間差異有顯著性，其中CD4+T細(xì)胞中HLA-DR+細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞中HLA-DR+細(xì)胞均比正常對(duì)照組顯著增高;CD8+CD69+、CD8+HLA-DR+細(xì)胞的數(shù)量與病毒DNA載量之間呈正相關(guān)。結(jié)論CAHB患者存在細(xì)胞免疫功能紊亂和淋巴細(xì)胞異常激活現(xiàn)象，T淋巴細(xì)胞的激活以CD8+T細(xì)胞為主，其在抗病毒感染中起著重要作用。

關(guān)鍵詞:慢性;乙型肝炎;T淋巴細(xì)胞;CD69;HLA-DR

TheexpressionofactivatedantigensinperipheralbloodTlymphocytesubsetsinpatientswithchronicactivehepatitisB.

Abstract:ObjectiveToinvestigatetheexpressionofspecialmarkerforactivationofperipheralbloodTlymphocytesinpatientswithchronichepatitisBvirusanditssignificance.MethodsImmunofluorescentthree-colorflowcytometrywasusedtostudytheexpressionofCD69andHLA-DRonTlymphocytesin30patientswithchronicactivehepatitisBvirusand31normalviralloadwasdeterminedbyfluorescencequantitativePCR.ResultsExpressionofCD3+Tcellsweresignificantlylowerinpa-tientsthanthatincontrols，meanwhiletheexpressionofCD4+Tcells%±%，significantlylowerthanthatofthecontrolsandtheexpressionofCD8+Tcell%±%，significantlyhigherthanthatofthecontrols.DetectionofCD69onCD3+Tcellsinpatients%±%，significantlyhigherthanthatofthecontrols.NOsignificantdifferenceintheexpressionofCD69onCD4+Tcellswasobservedbe-tweenpatientsandthecontrols，andtheexpressionofCD69onCD8+Tcells%±%，significantlydif-ferentfromthatofthecontrols.TheexpressionofHLA-DRonCD3+Tcellsweresignificancedifferencebetweenpa-tientsandthatincontrols.ThepercentagesofCD4+TcellsexpressingHLA-DRinpatients%±%，significantlyhigherthanthatofthecontrols.SignificantdifferencewasobservedintheexpressionofHLA-DRonCD8+Tcellsinpatientsascomparedwithcontrols.TherewerepositivecorrelationsbetweenpercentagesofCD8+CD69+，CD8+HLA-DR+cellsandviralload.ConclusionThefindingssupportthatcellularimmunodeficiencyexistsinpatientsandthatTlymphocyteswereabnormallyactivatedintheactivationofperipheralbloodTlymphocytesinpatientsmainlyinvolvesCD8+subsetanditmayplayanimportantroleintheimmuneresponsetoantiviralinfection.

Keywords:Chronic，HepatitisB;T-lymphocytes;CD69;HLA-DR

乙型肝炎病毒是一種嗜肝DNA病毒，主要侵犯肝臟并在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，但對(duì)肝細(xì)胞無明顯殺傷作用，當(dāng)機(jī)體針對(duì)HBV產(chǎn)生免疫反應(yīng)時(shí)，才會(huì)引起肝臟病變。細(xì)胞免疫在乙型肝炎發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)的不同會(huì)導(dǎo)致不同的臨床結(jié)果出現(xiàn)［1］。此外，Rehermann［2］研究發(fā)現(xiàn)HBV病毒感染可使機(jī)體免疫細(xì)胞異常激活和功能紊亂。T細(xì)胞是細(xì)胞免疫功能的主要執(zhí)行者，包括CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)T細(xì)胞亞群活化抗原的研究在乙型肝炎發(fā)病中的報(bào)道較少。為了探討T細(xì)胞及其亞群的激活在CAHB發(fā)病機(jī)制中的作用，現(xiàn)采用免疫熒光三色標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)30例CAHB患者外周血早期活化抗原CD69和晚期活化抗原HLA-DR在T細(xì)胞上表達(dá)的變化，并分析其意義。

1材料和方法

材料

研究對(duì)象依據(jù)2000年中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲病學(xué)會(huì)、肝病學(xué)分會(huì)聯(lián)合修訂的病毒性肝炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)［3］確診的30例患者，其中男23例，女7例，平均年齡歲，所有患者的HBV血清標(biāo)志物均呈陽性，血清HBVDNA定量1×108拷貝/L，丙氨酸轉(zhuǎn)移酶異常正常3倍以上，檢測(cè)前1月未使用過糖皮質(zhì)激素類藥物或其他影響免疫功能的藥物治療;正常人31例，其中男21例，女10例;平均年齡歲，均排除有慢性傳染性疾病或感染性疾病，HBsAg陰性及丙氨酸轉(zhuǎn)移酶正常。

試劑及儀器三色熒光標(biāo)記單克隆抗體CD8FITC/CD69PE/CD3PerCP，CD4FITC/CD69PE/CD3PerCP和陰性同型對(duì)照γ1FITC/γ1PE/CD3PerCP以及CD3PerCP，紅細(xì)胞裂解液為BDFACSTMLysingsolution以上產(chǎn)品均購自美國(guó)BectonDickinson公司，HLA-DR-FITC、CD4-PCY5、CD8-PCY5單抗和同型對(duì)照IgG2b為法國(guó)Immunotech公司產(chǎn)品。FACSCalibur流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司生產(chǎn)。HBV核酸擴(kuò)增熒光定量PCR試劑盒為深圳匹基生物工程股份有限公司產(chǎn)品，PCR儀為Roche公司的lightcycler熒光定量核酸檢測(cè)儀。

方法

標(biāo)本收集取患者及正常人靜脈血5ml，分兩管，一管用肝素抗凝，用于流式細(xì)胞檢測(cè)，另一管不加抗凝劑，分離血清后用于肝功能和HBV-DNA病毒載量測(cè)定。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞及其活化抗原肝素抗凝血分裝6管，每管加100μl全血，再分別加入10μl上述三種三色熒光標(biāo)記單抗試劑以及CD4-PCY5、CD8-PCY5、CD3PerCP和HLA-DRFITC單抗及同型對(duì)照IgG2b，4℃避光孵育20min，加紅細(xì)胞溶解液2ml混勻，室溫放置5min，離心棄上清，用PBS洗滌2次，將細(xì)胞重懸于1%多聚甲醛固定液500μl中，用FACSCalibur流式細(xì)胞儀CellQuest軟件獲取收集30000個(gè)細(xì)胞/管，用前向散射角及側(cè)向散射角確定淋巴細(xì)胞群再以PerCP標(biāo)記CD3+的細(xì)胞射門并分析數(shù)據(jù)，以熒光抗體染色陽性細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞的百分率記錄結(jié)果。

病毒DNA載量檢測(cè)采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法，嚴(yán)格按操作說明書要求進(jìn)行檢測(cè)，將結(jié)果換算成對(duì)數(shù)值備用。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有資料采用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，各組間比較取均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行t檢驗(yàn)，各參數(shù)與病毒載量的相關(guān)性用Spearman相關(guān)分析。

2結(jié)果

CAHB患者外周血T細(xì)胞亞群的分析患者外周血CD3+T細(xì)胞水平與正常對(duì)照組相比明顯降低;患者外周血CD3+CD4+T細(xì)胞水平顯著低于正常對(duì)照組;患者外周血CD3+CD8+T細(xì)胞水平顯著高于正常對(duì)照組。CD4+T、CD8+T的百分率與病毒DNA載量之間無相關(guān)性。結(jié)果見表1。

表1CAHB患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)

Tab1ExpressionofTlymphocytesubsetsonperipheralbloodinpatients

注:與對(duì)照組相比，※;※※。

Note:Comparedwithnormalcontrolgroup，※;※※。

CAHB患者T細(xì)胞上CD69表達(dá)患者外周血CD3+T細(xì)胞CD69的表達(dá)水平與正常人對(duì)照組比較差異有顯著性，其中CD4+T細(xì)胞CD69的表達(dá)水平與正常人對(duì)照組比較差異無顯著性，CD8+T細(xì)胞CD69的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組;相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，CD8+CD69+T細(xì)胞的表達(dá)水平與病毒DNA載量之間正相關(guān)，CD4+CD69+T細(xì)胞的表達(dá)水平與病毒DNA載量之間無相關(guān)性。結(jié)果見表2、圖1。

表2CAHB患者外周血T細(xì)胞上CD69表達(dá)

Tab2ExpressionofCD69+onperipheralbloodlymphocytesinpatients

注:與對(duì)照組相比，*。

Note:Comparedwithnormalcontrolgroup，*。

圖1CD8+CD69+T細(xì)胞表達(dá)與病毒DNA載量相關(guān)性分析

Fig1AnalysisofcorrelationsbetweentheviralloadandCD8+CD69+cells

CAHB患者T細(xì)胞上HLA-DR+表達(dá)CD3+T細(xì)胞中HLA-DR+細(xì)胞與正常人對(duì)照組之間差異有顯著性，其中CD4+T細(xì)胞HLA-DR+的表達(dá)與正常人對(duì)照組之間差異有顯著性，CD8+T細(xì)胞中HLA-DR+細(xì)胞比對(duì)照組顯著增高;相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)CD8+HLA-DR+細(xì)胞的數(shù)量與病毒DNA載量之間正相關(guān)CD4+HLA-DR+細(xì)胞的數(shù)量與病毒DNA載量之間無相關(guān)性。結(jié)果見表3、圖2。

表3CAHB患者外周血T細(xì)胞上HLA-DR+的表達(dá)

Tab3ExpressionofHLA-DR+onperipheralbloodlymphocytesinpatients

注:與對(duì)照組相比，※;※※。

Note:Comparedwithnormalcontrolgroup，※;※※。

圖2CD8+HLA-DR+T細(xì)胞表達(dá)與病毒DNA載量相關(guān)性分析

Fig2AnalysisofcorrelationsbetweentheviralloadandCD8+HLA-DR+Tcells

3討論

人類正常的免疫過程有賴于免疫細(xì)胞，在各類病毒性肝炎中，T細(xì)胞在乙型肝炎病變過程中的作用最為明顯，T細(xì)胞功能具有雙重性，在清除病毒和控制病毒擴(kuò)散的同時(shí)，也與病情的加重有關(guān)。Sing［1］研究表明，各種乙型肝炎患者均存在不同程度的細(xì)胞免疫功能紊亂，其中T細(xì)胞亞群變化明顯的是慢性活動(dòng)性乙肝，表現(xiàn)為外周血CD4+T細(xì)胞數(shù)量降低，CD8+T數(shù)量增高，與本文檢測(cè)的檢測(cè)結(jié)果一致，說明慢性肝炎活動(dòng)期隨著肝臟病變加重，細(xì)胞免疫損傷嚴(yán)重，成熟T細(xì)胞遭到破壞，造成CD4+T細(xì)胞數(shù)量減少，而CD8+T細(xì)胞作為主要的免疫效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量的增加與病毒的清除有關(guān)，CD8+T細(xì)胞在清除病毒的同時(shí)也造成肝細(xì)胞大量破壞，引起臨床上血清ALT持續(xù)升高，患者癥狀加重。

CD69抗原又稱早期激活抗原，活化誘導(dǎo)分子，是表達(dá)于絲裂原或抗原刺激的各種激活T、B、NK細(xì)胞的最早期標(biāo)志之一。在正常情況下外周血循環(huán)中極少有表達(dá)CD69的T細(xì)胞，但在特異性抗原或促有絲分裂原刺激下1～2h細(xì)胞表面CD69的表達(dá)即可測(cè)出并迅速達(dá)到高峰，表達(dá)可持續(xù)72h。CD69的功能是上調(diào)白介素2受體的p55鏈，產(chǎn)生Th1樣細(xì)胞因子，引發(fā)淋巴細(xì)胞增殖，起信號(hào)傳遞功能［4］。Goncalves［5］通過對(duì)HBV疫苗的研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞CD69表達(dá)與HBV感染關(guān)系密切，認(rèn)為T細(xì)胞CD69表達(dá)的降低是機(jī)體對(duì)HBV無反應(yīng)的結(jié)果。以流式細(xì)胞儀分析30例CAHB患者外周血T淋巴細(xì)胞CD69抗原的表達(dá)，結(jié)果顯示機(jī)體受到HBV感染后，特異性抗原的刺激使患者免疫系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)性改變，T細(xì)胞CD69表達(dá)增高。通過對(duì)患者T細(xì)胞亞群的研究發(fā)現(xiàn)，患者的CD8+殺傷性T細(xì)胞對(duì)HBV病毒的反應(yīng)一直處于高水平激活狀態(tài)，CD4+輔助性T細(xì)胞早期活化抗原處于低水平激活狀態(tài)，機(jī)體通過活化及產(chǎn)生的特異性抗病毒的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，從而達(dá)到清除病原體的目的。

人類主要組織相容性復(fù)合物是人體細(xì)胞重要的表面抗原，而HLA-DR是MHC-Ⅱ類分子的主要抗原之一。正常情況下，它僅分布于B細(xì)胞、活化的T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和精子等，是免疫反應(yīng)中重要的參與者，HLA-DR在免疫應(yīng)答中的主要作用是與T細(xì)胞表面的CD4+分子和/或抗原結(jié)合，促進(jìn)抗原傳遞，在抗原提呈中起著第一信號(hào)作用［6］，HLA-DR在靜息的T細(xì)胞上表達(dá)很弱，T細(xì)胞激活時(shí)，其表達(dá)顯著升高。與CD69抗原不同，HLA-DR激活標(biāo)志在T細(xì)胞激活晚期表達(dá)且表達(dá)時(shí)間最長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)患者組CD3+細(xì)胞HLA-DR表達(dá)增高，與蔡莉靜結(jié)果一致［7］，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)HLA-DR在CD4+、CD8+T細(xì)胞中均顯著增高，提示機(jī)體的免疫系統(tǒng)對(duì)病毒感染一直處于較高的應(yīng)答狀態(tài)，通過HLA-DR表達(dá)的增高，一方面調(diào)節(jié)機(jī)體免疫失調(diào)的狀況，另一方面可能與乙肝的自身免疫反應(yīng)有關(guān)［8］。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)CD8+CD69+T、CD8+HLA-DR+T細(xì)胞的數(shù)量與病毒DNA載量呈正相關(guān)，可能是由于大量病毒抗原刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，機(jī)體試圖通過異常激活CTL，使CTL活性增強(qiáng)發(fā)揮其殺傷功能，從而有助于病毒的清除。

觀察T淋巴細(xì)胞表面分子及其不同亞群活化抗原的表達(dá)能較全面直觀地了解機(jī)體的免疫狀態(tài)。本文應(yīng)用熒光三色流式細(xì)胞術(shù)通過對(duì)CAHB患者外周血T細(xì)胞及其活化抗原表達(dá)的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)患者存在細(xì)胞免疫功能異?，F(xiàn)象，尤其是CD8+T細(xì)胞及其活化抗原的表達(dá)的增高表明它們?cè)诳共《靖腥具^程中起重要作用，有關(guān)CD8+T細(xì)胞活化抗原的表達(dá)能否反映病情及指導(dǎo)治療有待臨床進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn):

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