淮海工學(xué)院生物化學(xué)大實(shí)驗(yàn)報(bào)告niujun10800字

淮海工學(xué)院生物化學(xué)大實(shí)驗(yàn)報(bào)告niujun10800字

海洋學(xué)院綜合大實(shí)驗(yàn)報(bào)告專業(yè)：生物技術(shù)班級(jí)生技121班姓名：newjhon學(xué)號(hào)：21題目：生物化學(xué)大實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)教師：孫玉英學(xué)年20xx年12月22日--2015年1月2日酶的特異性及溫度、pH對(duì)酶活性的影響班級(jí)：生技121姓名：牛軍學(xué)號(hào)：20121211111【摘要】本實(shí)驗(yàn)采用控制變量法分別研究唾液淀粉酶的特異性以及溫度、pH對(duì)該酶活性的影響，得出結(jié)論：唾液淀粉酶對(duì)淀粉有水解作用；在37℃和pH6.8時(shí)，酶的作用效果分別是最好的?！娟P(guān)鍵詞】唾液淀粉酶，溫度，pH，特異性1前言唾液淀粉酶是由唾液腺分泌的一種水解酶，具有水解可溶性淀粉、直鏈淀粉、糖原等α-1,4-葡聚糖，水解α-1,4-糖苷鍵的酶。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較在不同條件下唾液淀粉酶對(duì)淀粉水解后的顯色反應(yīng)顏色的不同，進(jìn)而了解不同溫度、pH對(duì)唾液淀粉酶活性的影響以及該酶的特異性。2材料及方法2.1材料主要材料為人的唾液以及淀粉溶液2.1.1試劑蒸餾水NaCl（分析純，中國(guó)上海試劑一廠），可溶性淀粉（化學(xué)純，廣州醫(yī)藥站化學(xué)試劑公司），蔗糖（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），CuSO4（分析純，上海試一化學(xué)試劑有限公司），檸檬酸鈉（分析純，中國(guó)上海試劑一廠），無(wú)水Na2CO3（分析純，南京化學(xué)試劑一廠），KI（化學(xué)純，南京化學(xué)試劑有限公司），Na2HPO4·2H2O（分析純，江蘇省連云港市化學(xué)試劑廠），濃HCl（分析純，南京化學(xué)試劑有限公司），NaOH。2.1.2配制試劑①唾液淀粉酶的制備：用燒杯取蒸餾水或自來(lái)水，含于口中，1—2分鐘后，吐入50mL燒杯中，備用。②Benedict試劑A、取CuSO417.3g溶于100mL熱蒸餾水中，冷后稀釋至150mL；B、取檸檬酸鈉173g及無(wú)水Na2CO3100g，加水600mL加熱使之溶解，冷后稀釋至850mL；1C、將A液緩慢注入B液中，混勻備用。（可長(zhǎng)期保存）。③pH1.5溶液：取0.2MNa2HPO4·2H2O溶液41.2mL加入0.1M檸檬酸鈉38.8mL，然后用濃HCl調(diào)至pH1.5左右；④pH6.8溶液：取0.2MNa2HPO4·2H2O溶液61.8mL加入0.1M檸檬酸鈉18.2mL；取0.2MNa2HPO4·2H2O溶液77.8mL加入0.1M檸檬酸鈉2.2mL，然后用⑤pH9.8溶液：0.1MNaOH調(diào)至pH9.8左右；⑥0.3%NaCl的0.5%的淀粉液：稱取可溶性淀粉1.25g、NaCl0.75g于燒杯中，加入200mL水，于電爐上加熱，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直至液體澄清。待冷卻后轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶，定容。⑦0.5%的蔗糖溶液：稱取蔗糖0.5g，加水溶解，定容至100mL。稱取碘化鉀3g溶于蒸餾水中，待全部溶解后再加I1g，振蕩溶解，定容⑧KI-I溶液：至100mL。2.1.3儀器試管（10支）移液管（7支）大燒杯（1000ml）HW·YS型電子恒溫水?。?7℃）石棉網(wǎng)洗耳球玻璃棒膠頭滴管，小燒杯（50，100ml）BP221S型電子天平pH試紙，容量瓶試管架2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1酶的特異性（1）取兩支試管編號(hào)①、②，①號(hào)加入0.5%的淀粉液2mL,②號(hào)加入0.5%的蔗糖液2mL；（2）與兩支試管各加入制備好的唾液1mL；（3）將兩支試管同時(shí)放入37℃恒溫水浴鍋中保溫；（4）15分鐘后，取出兩試管，各加入Benedict試劑1mL；（5）將兩試管同時(shí)放入沸水中煮沸6分鐘；（6）取兩支試管，觀察記錄顏色的變化，并注意是否有紅棕色產(chǎn)生。A型50Hz220V—800W雙層鐵皮電爐2表1酶的特異性驗(yàn)證2.2.2溫度對(duì)酶活性的影響①取三支試管并編號(hào)①、②、③，同時(shí)加入5mL0.5%淀粉液及1mL唾液混勻；②將管①、管②、管③同時(shí)分別放入冰浴、37℃水浴、沸水浴中；③15分鐘后，取出各管，分別加入碘液數(shù)滴，觀察并記錄各管顏色變化。表2溫度對(duì)酶活性的影響2.2.3pH對(duì)酶活性的影響①取試管3支編號(hào)6、7、8，按下表加入試劑；②3支試管同時(shí)放入37℃恒溫水浴鍋內(nèi)保溫；③15分鐘后，取出3支試管，分別加入碘試劑數(shù)滴，每加一滴，注意搖勻，觀察并記錄顏色變化。表3pH對(duì)酶活性的影響33結(jié)果與分析3．1實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1.1酶的特異性實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象：①號(hào)試管經(jīng)沸水浴后，試管內(nèi)顏色仍為藍(lán)色，但在試管底部可以看出有些許磚紅色沉淀出現(xiàn)；②號(hào)試管經(jīng)沸水浴后顏色沒(méi)有發(fā)生變化(仍為淺藍(lán)色。（如圖1）②號(hào)試管①號(hào)試管圖1酶的特異性實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象表明：唾液淀粉酶能水解淀粉，而不能水解蔗糖。說(shuō)明唾液淀粉酶具有特異性。3.1.2溫度對(duì)酶活性的影響實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象：①號(hào)試管加5滴碘液并混勻后顏色趨近與碘液原來(lái)的顏色，但較②號(hào)試管顏色較深；②號(hào)試管加5滴碘液并混勻后也趨近碘液本身顏色，但比碘液顏色淺；③號(hào)試管加5滴碘液并混勻后變成深藍(lán)紫色。（如圖2）。①②③圖2溫度對(duì)酶活性的影響實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象表明：經(jīng)過(guò)冰水浴后，唾液淀粉酶活性降低，但仍能將淀粉分解成葡萄糖；而在37℃條件下唾液淀粉酶活性較高，將淀粉分解成葡萄糖。說(shuō)明低溫對(duì)唾液淀粉酶活性有一定影響。經(jīng)過(guò)沸水浴后，唾液淀粉酶變性，不能分解淀粉。3.1.3pH對(duì)酶活性的影響實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象：①號(hào)試管逐滴加入3滴碘液并混勻后變成酒紅色；②號(hào)試管逐滴加入3滴碘液并混勻后接近碘液本身的顏色；③號(hào)試管逐滴加入3滴碘液并混勻后變成淺藍(lán)黃色。（如圖3）。4①②③圖3pH對(duì)酶活性的影響實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象表明：pH為1.5（強(qiáng)酸性）條件下，唾液淀粉酶可以水解淀粉；pH為6.8（接近中性）條件下，唾液淀粉酶活性較高，能水解淀粉；pH為9.8（堿性）條件下，唾液淀粉酶仍能水解淀粉，只是較pH1.5和pH9.8相比，酶的活性較弱。3.2結(jié)果分析本實(shí)驗(yàn)研究酶的特異性及溫度、pH對(duì)酶活性的影響得到以下結(jié)果：唾液淀粉酶只能水解淀粉而不能水解蔗糖，驗(yàn)證了酶的特異性，與理論相符。在溫度對(duì)酶活性影響實(shí)驗(yàn)中，由顏色變化可以得出結(jié)論：高溫降低酶活性，低溫對(duì)酶活有較小的抑制作用。在pH對(duì)酶活性影響實(shí)驗(yàn)中，得出的結(jié)論是：高pH對(duì)酶活抑制較大，低pH對(duì)酶活抑制較小。4討論從實(shí)驗(yàn)中可以得出結(jié)論：唾液淀粉酶具有高度特異性，其活性受溫度、pH值等多種因素影響。但本組實(shí)驗(yàn)所得磚紅色沉淀較少，有些實(shí)驗(yàn)組沒(méi)有沉淀產(chǎn)生，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)與預(yù)期不一的原因是由于唾液淀粉酶含量存在明顯的個(gè)體差異，因而為了確定恰當(dāng)?shù)耐僖合♂尡稊?shù)和反應(yīng)時(shí)間，建議在原實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目之前增加唾液稀釋倍數(shù)確定實(shí)驗(yàn)。唾液淀粉酶活性存在明顯的性別差異[1]和個(gè)體差異，不同個(gè)體的酶活性相差達(dá)到上百倍，其主要是由于編碼該酶的基因在體內(nèi)的拷貝數(shù)差異所決定的[2-3]在進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中會(huì)發(fā)現(xiàn)不同同學(xué)的唾液淀粉酶活力不同，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用的唾液的稀釋倍數(shù)也不同。本實(shí)驗(yàn)探究溫度對(duì)酶活性影響的結(jié)論與預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果有差異，且發(fā)現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)證明酶的活性在沸水浴(95℃)中并沒(méi)有受到影響，反而比恒溫水浴(37℃)反應(yīng)的更徹底[4]；本實(shí)驗(yàn)探究溫度對(duì)酶活性影響的結(jié)論與預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一，需要改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方案：不要檢測(cè)反應(yīng)物(淀粉)，用斐林試劑檢測(cè)產(chǎn)物(還原糖)進(jìn)行判斷，且注意斐林試劑的用量為5%HCl用量的2倍[5]。因此，要進(jìn)一步探究溫度、pH對(duì)酶活性的影響，確定酶的最適溫度和最適pH，需要更加嚴(yán)格周密的實(shí)驗(yàn)方案。55參考文獻(xiàn)[1]歸改霞.性別不同對(duì)唾液淀粉酶活性影響的研究.衛(wèi)生職業(yè)2013,31(24):110-11[2]PerryGH,DominyNJ,ClawKG,etal.Dietandtheevolutionofhumanamylasegenecopynumbervariation[J].NatGenet,2007,39:1256-1260.[3]MandelAL,PeyrotdesGachonsC,PlankKL,etal.IndividualDifferencesinAMY1genecopynumber,salivarya-amylaselevelsandtheperceptionoforalstarch[J].PLoSONE,2010,5:13352.[4]馬彥玲.不同溫度影響唾液淀粉酶活性實(shí)驗(yàn)操作流程的再改進(jìn).河南職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2013,25(5):613-616[5]范淑秋.pH影響淀粉酶活性的探究.生物學(xué)通報(bào),2008,43(10):49-506血紅蛋白凝膠過(guò)濾層析班級(jí)：生技121【摘要】本實(shí)驗(yàn)利用SephadexG－25制備凝膠柱，通過(guò)凝膠過(guò)濾層析的方法，從新鮮雞血中制備雞的血紅蛋白，經(jīng)洗脫液不斷洗脫最終收集到含有雞血紅蛋白的樣液。【關(guān)鍵詞】凝膠過(guò)濾層析，血紅蛋白,分離純化1前言分離和提純蛋白質(zhì)方法多種多樣，其中最為重要的兩種方法就是電泳和層析，在這些方法中主要是利用蛋白質(zhì)之間各種特性的差異，包括分子的大小和形狀、酸堿性質(zhì)、溶解度、吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的生物學(xué)親和力[1]。凝膠過(guò)濾是一種利用凝膠按照分子大小分離物質(zhì)的層析方法，又稱分子排阻層析、分子篩層析等,它是利用某些化學(xué)惰性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)(凝膠)為填料,通過(guò)洗脫液的連續(xù)洗脫,使混合物中的各種物質(zhì)按其分子體積大小和形狀的差異而得到分離,已廣泛應(yīng)用于大分子物質(zhì)的去鹽、溶液的濃縮、分離提純及分子量測(cè)定等方面[2]。凝膠過(guò)濾層析具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、分離迅速和不影響樣品生物活性等優(yōu)點(diǎn),但凝膠過(guò)濾層析對(duì)蛋白混合物的最佳分離效果受許多因素的影響。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)，了解凝膠柱層析的原理及應(yīng)用，掌握凝膠柱層析的基本操作技術(shù)，為進(jìn)一步掌握離子交換柱層析、親和層析及吸附層析等其它分離方法打下良好基礎(chǔ)。2材料與方法2.1材料2.1.1實(shí)驗(yàn)材料新鮮雞血Na2HPO4·2H2O（分析純，江蘇省連云港市化學(xué)試劑廠）；NaH2PO4·2H2O（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；蒸餾水；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA－Na2）（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）（分析純，江蘇徐州試劑二廠）；SephadexG－25；固體鐵氰化鉀〔K3Fe（CN）6〕；檸檬酸鈉（分析純，中國(guó)上海試劑一廠）2.1.3配置試劑7姓名：牛軍學(xué)號(hào)：201212111112.1.2藥品①磷酸緩沖液（pH7.0）：稱取Na2HPO4·2H2O2.172g，NaH2PO4·2H2O1.076g，溶于蒸餾水中，定容至1000mL。②Na2HPO4—EDTA—Na2溶液：稱取2.69gEDTA—Na2，3.56gNa2HPO4·2H2O，加蒸餾水溶解并定容至100mL。③40mmol/LFeSO4溶液：稱取FeSO4·7H2O1.11g溶于100mL水中（現(xiàn)配現(xiàn)用）。①凝血：添加抗凝劑（150g/LEDTA.k2）的新鮮雞血2.1.4儀器BP221S型電子天平玻璃棒洗耳球2.2方法2.2.1凝膠溶脹[3]取10gSephadexG－25，加200mL蒸餾水充分溶脹。待凝膠溶脹平衡后，用傾瀉法除去細(xì)小顆粒，再加入與凝膠等體積的pH7.0磷酸緩沖液，在真空干燥器中減壓除氣（過(guò)夜），準(zhǔn)備裝柱。2.2.2裝柱將層析柱垂直固定，旋緊柱下端的螺旋夾，在柱內(nèi)加入少量磷酸緩沖液或直接把處理好的凝膠連同適當(dāng)體積的緩沖液用玻棒攪勻，然后邊攪拌邊倒入層析柱中，同時(shí)開(kāi)啟螺旋夾，控制一定流速。裝柱后形成的凝膠床長(zhǎng)約20cm，使膠床表面保持2-3cm液層。2.2.3平衡繼續(xù)用磷酸緩沖液洗脫，調(diào)整緩沖液流速，平衡20-30分鐘。2.2.4樣品制備（1）取1mL雞的抗凝血放入小燒杯中，加5mLpH7.0的磷酸緩沖液，再加入27.5mgK3Fe(CN)6固體，用玻棒攪動(dòng)使其溶解，即得褐色的高鐵血紅蛋白溶液。（2）吸取lmLFeSO4溶液和lmLEDTA-Na2-NaHPO4溶液，于小燒杯中混勻。2.2.5上樣旋開(kāi)層析柱上端旋扭，待膠床上部的緩沖液幾乎全部進(jìn)入凝膠（即緩沖液液面與膠床平面相切）時(shí)，立即加入0.4mL上述混合液，待其進(jìn)入膠床表面僅留約lmm液層時(shí)，加入0.5mL緩沖液，再當(dāng)膠床表面僅留約lmm液層時(shí)，吸取0.5mL血紅蛋白樣品溶液，小心地注入層析柱膠床面中央。慢慢打開(kāi)螺旋夾，待大部分8層析柱（Φ1cm×20cm）燒杯（50ml,100ml,500ml）移液管（1mL，5mL，10ml）容量瓶（100ml,1000ml，2000ml）膠頭滴管樣品進(jìn)入膠床、床面上僅有l(wèi)mm液層時(shí)，用乳頭滴管加入少量緩沖液，使剩余樣品進(jìn)入膠床，然后用液管小心加入3—5cm高的洗脫緩沖液。2.2.6洗脫繼續(xù)用磷酸緩沖液洗脫，調(diào)整流速，使上下流速同步保持每分鐘約6滴。等有紅色液體滴出時(shí)開(kāi)始收集液體，直至滴出液體顏色變淺。2.2.7凝膠的回收。實(shí)驗(yàn)完畢用洗脫液把柱內(nèi)有色物質(zhì)洗脫干凈，保留凝膠柱重復(fù)使用。3結(jié)果與分析3.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果凝膠經(jīng)溶脹、裝柱、沉降后形成膠床，用磷酸緩沖液平衡后，沿層析柱內(nèi)壁加入FeSO4、EDTA-Na2-NaHPO4混合溶液，等其進(jìn)入膠后往膠床面中央加入雞血血紅蛋白，等其進(jìn)入膠床后加入磷酸緩沖液。血紅蛋白在膠床中緩慢層析，分為三層：上層呈現(xiàn)黃色，是鐵氰化鉀；中層呈現(xiàn)暗紅色，是雞血中的小分子物質(zhì)及少量血紅蛋白；最下層呈現(xiàn)鮮紅色。收集層析柱中的紅色的液體部分即為血紅蛋白。本次實(shí)驗(yàn)收集的血紅蛋白的量大約2mL。3.2結(jié)果分析本次實(shí)驗(yàn)中，層析的樣品在膠床內(nèi)分三層，符合理論；在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，樣品洗脫速度較為合適，流速基本控制在每分鐘6滴，洗脫獲得的血紅蛋白較其他實(shí)驗(yàn)組顏色略淺，總體而言，本實(shí)驗(yàn)是比較成功的，但在一些方面仍需要改進(jìn)：成功之處：①層析速度控制準(zhǔn)確，樣品的條帶清晰，分層清楚；②層析過(guò)程中操作規(guī)范，加樣準(zhǔn)確，層析結(jié)果較好。不足之處：①配制FeSO4溶液時(shí)，由于操作不及時(shí)，導(dǎo)致FeSO4被氧化，進(jìn)而重新配制；9②有血紅蛋白層析出時(shí)未能及時(shí)收集，導(dǎo)致部分血紅蛋白損失。③層析后的柱子污染較為嚴(yán)重，抗凝血在層析前能離心處理下最好。④實(shí)驗(yàn)后，沒(méi)有保持柱子處于緩沖體系中，出現(xiàn)柱子變干的情況。4討論凝膠層析主要根據(jù)被測(cè)樣品分子量的差異,在固定相上受到阻滯程度不同而達(dá)到分離的目的。分子量大的物質(zhì)隨流動(dòng)相移動(dòng)速度較快,先流出層析床。反之,分子量小的物質(zhì)移動(dòng)速度較慢,后流出[4]。凝膠過(guò)濾層析的操作條件比較溫和，可在相當(dāng)廣的溫度范圍下進(jìn)行，葡聚糖凝膠的吸附力弱，不需要有機(jī)溶劑，并且對(duì)分離成分理化性質(zhì)的保持有獨(dú)到之處。對(duì)于高分子物質(zhì)有很好的分離效果，也可用于去除高分子物質(zhì)（如核酸、蛋白質(zhì)、多糖等）中的一些小分子雜質(zhì)。測(cè)定已知分子量的物質(zhì)通過(guò)凝膠過(guò)濾層析洗脫體積，再測(cè)定未知分子量的大分子物質(zhì)體積，從而測(cè)定高分子物質(zhì)的分子量。鑒于凝膠層析法的高分離率、高靈敏度及操作簡(jiǎn)單,保持樣品的生物活性等優(yōu)點(diǎn),這種方法已廣泛應(yīng)用于大分子物質(zhì)的去鹽、溶液的濃縮、分離提純及分子量測(cè)定。5參考文獻(xiàn)[1]史偉，禹婷.蛋白質(zhì)的層析分離內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技,2011（1）：110-112[2]方福德,周呂,丁濂,等.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技巧全書(shū)[M].北京:北京醫(yī)科大學(xué)中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,1995[3]王璞,林紅,朱濱.凝膠過(guò)濾層析實(shí)驗(yàn)中Sephadex的溶脹與回收保存.中國(guó)科技論文統(tǒng)計(jì)源期刊,2006,23(2):24-25[4]楊歌德,姜玉梅,周宏博.凝膠過(guò)濾層析分離蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)中三種過(guò)濾介質(zhì)分離效果的比較.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2002,36(3):242-24310SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳—蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定班級(jí)：生技121【摘要】本實(shí)驗(yàn)利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定凝膠過(guò)濾分離的雞血血紅蛋白的分子量。通過(guò)電泳后的條帶計(jì)算樣品遷移率，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線，估算血紅蛋白分子量。【關(guān)鍵詞】SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，血紅蛋白，分子量1前言SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳是一種用作測(cè)定蛋白質(zhì)分子量常用的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法。它的基本原理是SDS與蛋白質(zhì)分子結(jié)合,形成復(fù)合物。而且各種蛋白-SDS復(fù)合物在凝膠電泳中的遷移率只與蛋白質(zhì)的分子量有關(guān)系。用這種方法測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量,操作簡(jiǎn)便,快速,所需設(shè)備廉價(jià),所得結(jié)果在分子量為15kD-200kD的范圍內(nèi),與用其他方法測(cè)得的分子量相比,誤差一般在正負(fù)10%以內(nèi)[1]:聚丙烯酰胺凝膠是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),具有分子篩效應(yīng),可以根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的不同而分離蛋白質(zhì)。電泳時(shí),分子量小的蛋白質(zhì)跑得快在下面,而分子量大的蛋白質(zhì)跑得慢在上面SDS在蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域有著重要作用。2材料與方法2.1材料雞血血紅蛋白2.1.1試劑SDS（十二烷基硫酸鈉）（化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）丙烯酰胺（Acr）（化學(xué)純，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司）N,N’甲叉雙丙烯酰胺（Bis）（化學(xué)純，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司）Tris（化學(xué)純，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司）甘氨酸（Gly）（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）NaH2PO4（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）Na2HPO4（分析純，江蘇省連云港市化學(xué)試劑廠）考馬斯亮藍(lán)R—250（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）50%甲醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）冰乙酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）蒸餾水過(guò)硫酸銨（化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）HCl（分析純，南京化學(xué)試劑有限公司）巰基乙醇（化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）甘油（分析純，宜興市鈕家化學(xué)試劑廠）溴酚藍(lán)（分析純，上?；瘜W(xué)試劑總廠）11姓名：牛軍學(xué)號(hào)：20121211111四甲基乙二胺（TEMED）（化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）2.1.2配置試劑①10%過(guò)硫酸銨：稱取1.002g過(guò)硫酸銨固體粉用蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用蒸餾水定容。②凝膠注液：稱取Acr29g，Bis1g于燒杯中，然后加蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線，蓋上瓶塞倒轉(zhuǎn)搖勻。③樣品溶解液：SDS4.02g，巰基乙醇0.4mL，甘油4mL，溴酚蘭0.01g，pH7.2磷酸緩沖液2mL。加蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線，蓋上瓶塞倒轉(zhuǎn)搖勻。④4X濃縮膠buffer：稱取Tris6.0153g,用HCl調(diào)pH到6.8，然后加入SDS0.4070加水至100mL。⑤4X分離膠buffer：稱取Tris36.3598g,用80mL蒸餾水溶解，再用濃HCl調(diào)pH到8.8，然后加入SDS0.808g，60℃水浴溶解，加蒸餾水至200mL。⑥電泳buffer：稱取Tris12.1875g，Gly57.748g和檸檬酸4.0149g,放入到500mL大燒杯中，加蒸餾水60℃水浴溶解，轉(zhuǎn)移至2000mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線，蓋上瓶塞倒。⑦0.2mol/L，pH7.2磷酸鹽緩沖溶液：取280mol/L.0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液，加入720mL0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液，混勻后在pH計(jì)上調(diào)至pH7.2。⑧染色液：稱取0.25g考馬斯亮藍(lán)R-250，454mL50%甲醇，46mL冰乙酸于燒杯中，轉(zhuǎn)移至500mL容量瓶中。⑨脫色液：75mL冰乙酸，875mL蒸餾水與50mL甲醇混合。2.1.3儀器DYC2-24D型垂直板型電泳槽；移液管（1mL、5mL、10mL）；微量進(jìn)樣器（50μL）；培養(yǎng)皿（直徑120mm）；電吹風(fēng)；DYY-2C型直流穩(wěn)壓電泳儀；燒杯（25mL、50mL、100mL）；細(xì)長(zhǎng)滴管；手術(shù)刀片；電爐。122.2方法2.2.1安裝垂直板電泳槽、凝膠制備先把垂直平板電泳槽和兩塊玻璃板洗凈，晾干。這種電泳槽兩側(cè)為有機(jī)玻璃制成的電極槽，兩個(gè)電極槽中間夾有一個(gè)凝膠模，該模由1個(gè)U形硅膠框、長(zhǎng)與短的玻璃板及樣品槽模板（梳子）所組成。先把垂直平板電泳槽和兩塊玻璃板洗凈，晾干。通過(guò)U形膠帶將兩塊玻璃板封好，由此便形成一個(gè)“夾心”凝膠腔，再將封好的玻璃板插入電泳槽。注意操作過(guò)程中勿用手接觸灌膠的玻璃面。為了檢驗(yàn)裝好的電泳槽是否漏膠，可以先加少量水檢驗(yàn)封好的玻璃板是否會(huì)漏膠，確定不漏后將水倒出，并用吸水紙吸干凝膠腔中的水分。按照表1所示制備凝膠表1凝膠制備方法用吸管吸取分離膠，沿壁緩緩注入已準(zhǔn)備好的膠室中，膠液加到離膠室頂部1.5厘米處。注膠后應(yīng)立即覆蓋3-5毫米的水層，垂直靜止聚合30分鐘左右。聚合后將覆蓋的水層倒出，并吸干。2.2.2加樣一般每個(gè)凹形樣品槽內(nèi)，只加一個(gè)種樣品或已知分子量的混合標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，將樣品與已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白加在同一塊凝膠上，加樣體積要根據(jù)凝膠厚及樣品濃度靈活掌握，本實(shí)驗(yàn)加樣體積為20μL。如樣品槽中有所泡，可用注射器針頭挑除。加樣時(shí)，將微量注射器的針頭通過(guò)電極緩沖液伸入加樣槽內(nèi)，盡量接近底部，輕輕推動(dòng)微量注射器，注意針頭勿碰破凹形槽膠面。由于樣品溶解液中含有比重較大的蔗糖或甘油，因此樣品溶液會(huì)自動(dòng)沉降在凝膠表面形成樣品層。2.2.3電泳加樣后，將電極緩沖液分別倒入上下電泳槽，連接電泳儀與電泳槽，上槽接負(fù)極，下槽接正極。打開(kāi)電源，先將電流調(diào)至25mA，10min候，將電流調(diào)至75mA，待染料前沿遷移至距硅橡膠框底邊1-1.5cm處停止電泳，關(guān)閉電源，一般電泳過(guò)程需5-6h。2.2.4染色[3]與脫色13電泳結(jié)束后，取下凝膠模，卸下硅橡膠框，用解剖刀撬開(kāi)短玻璃板，在凝膠板切下一角作為加樣標(biāo)志，將凝膠從玻璃板上取下，放入大的培養(yǎng)皿中染色30～60min，用蒸餾水漂洗數(shù)次，然后放入脫色液中脫色。勤換脫色液，12小時(shí)后可清晰地辨認(rèn)出蛋白質(zhì)區(qū)帶，48小時(shí)后可脫至背景無(wú)色。若蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰，可將電泳圖譜照相保存。2.3Mr的計(jì)算通常以相對(duì)遷移率Mr來(lái)表示遷移率，相對(duì)遷移率的計(jì)算方法如下：用直尺分別量出樣品區(qū)帶中心及銅絲與凝膠頂端的距離，按下式計(jì)算：相對(duì)遷移率Mr＝樣品遷移距離（cm）染料遷移距離（cm）以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Mr的對(duì)數(shù)對(duì)相對(duì)遷移以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)Mr的對(duì)數(shù)對(duì)相對(duì)遷移率作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測(cè)樣品的相對(duì)遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其Mr。3結(jié)果與分析3.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果點(diǎn)樣時(shí)，從右往左的順序依次：①，②，③（前三組為本組實(shí)驗(yàn)條帶）；④，⑤（為溫奇秦組）⑥為Marker。很明顯，marker帶沒(méi)有跑出，各組的蛋白條帶也沒(méi)有跑出.樣品遷移率沒(méi)法計(jì)算，所以蛋白的分子量無(wú)法計(jì)算。3.2結(jié)果分析本組制備的血紅蛋白樣液沒(méi)有跑出條帶，標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker及其他組血紅蛋白樣液均沒(méi)有跑出條帶，說(shuō)明蛋白樣液的制備沒(méi)有問(wèn)題?？v觀整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程，本次實(shí)驗(yàn)沒(méi)有成功的原因可能有以下幾點(diǎn)：①Temed藥品作用效果不明顯，加大劑量后對(duì)蛋白電泳產(chǎn)生了影響②由于Temed在低pH值時(shí)失效，會(huì)使聚合作用延遲，所以可能是分離膠緩沖液和濃縮膠緩沖液的pH偏低14③由于濃縮膠凝固太慢，煮好的標(biāo)準(zhǔn)蛋白marker沒(méi)有即時(shí)使用，過(guò)夜后再次進(jìn)行沸水煮，很大可能使標(biāo)準(zhǔn)蛋白失效，依此推斷，樣品蛋白也失效。④凝膠中存在SDS,SDS的存在干擾了考馬斯亮藍(lán)與蛋白質(zhì)的結(jié)合，雖然甲醇可以破壞SDS，但可能是樣品溶解液中SDS過(guò)多導(dǎo)致染色失敗。4討論聚丙烯酰胺凝膠已成為目前生化實(shí)驗(yàn)最常用的支持介質(zhì)［2］，通過(guò)使用強(qiáng)陰離子SDS建立的SDS技術(shù)已成為蛋白質(zhì)分離、分析的常用方法［3－4］在用SDS凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)分子量時(shí)應(yīng)注意：要保證蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物達(dá)到1.4gSDS/g蛋白質(zhì)的比率并具有相同構(gòu)像；要根據(jù)所測(cè)蛋白質(zhì)分子量的范圍選擇最適凝膠濃度，并盡量選擇蛋白質(zhì)分子量范圍與性質(zhì)與待測(cè)樣品相近的蛋白質(zhì)作標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)；在凝膠電泳中，影響遷移率的隱私較多，而在制膠和電泳過(guò)程中，很難每次都將各項(xiàng)條件控制的完全一致，因此，用SDS-凝膠電泳法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量，每次測(cè)定樣品必須同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，而不得利用另一次電泳的標(biāo)準(zhǔn)曲線；不是所有的蛋白質(zhì)都能用SDS-凝膠電泳法測(cè)定其分子量，已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)用這種方法測(cè)出的分子量是不可靠的。因此，這一方法需要我們不斷探索創(chuàng)新，從而對(duì)其改良[5]，以發(fā)揮其優(yōu)越性，避免其不良方面。5參考文獻(xiàn)[1]張龍翔,張庭芳,李令媛.生化實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)北京:高等教育出版社,1987.86.[2]郭曉君．蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］．北京:科學(xué)出版社，1999．［3]范培昌．生物大分子印漬術(shù)和應(yīng)用［M］．上海:上?？茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，1989:106－107．［4]陳亞飛，孫宇．SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定蛇毒抗瘤蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量［J］．中國(guó)生化藥物，2004，25(5):300－303．[5]葉長(zhǎng)春.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳染色方法的改進(jìn)湖北工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2009,24(4):16-1815

＋淮海工學(xué)院生物化學(xué)大實(shí)驗(yàn)報(bào)告niujun發(fā)表于：2023.1.23來(lái)自：字?jǐn)?shù)：10877手機(jī)看范文海洋學(xué)院綜合大實(shí)驗(yàn)報(bào)告專業(yè)：生物技術(shù)班級(jí)生技121班姓名：newjhon學(xué)號(hào)：21題目：生物化學(xué)大實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)教師：孫玉英學(xué)年20xx年12月22日--2015年1月2日酶的特異性及溫度、pH對(duì)酶活性的影響班級(jí)：生技121姓名：牛軍學(xué)號(hào)：20121211111【摘要】本實(shí)驗(yàn)采用控制變量法分別研究唾液淀粉酶的特異性以及溫度、pH對(duì)該酶活性的影響，得出結(jié)論：唾液淀粉酶對(duì)淀粉有水解作用；在37℃和pH6.8時(shí)，酶的作用效果分別是最好的?！娟P(guān)鍵詞】唾液淀粉酶，溫度，pH，特異性1前言唾液淀粉酶是由唾液腺分泌的一種水解酶，具有水解可溶性淀粉、直鏈淀粉、糖原等α-1,4-葡聚糖，水解α-1,4-糖苷鍵的酶。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較在不同條件下唾液淀粉酶對(duì)淀粉水解后的顯色反應(yīng)顏色的不同，進(jìn)而了解不同溫度、pH對(duì)唾液淀粉酶活性的影響以及該酶的特異性。2材料及方法2.1材料主要材料為人的唾液以及淀粉溶液2.1.1試劑蒸餾水NaCl（分析純，中國(guó)上海試劑一廠），可溶性淀粉（化學(xué)純，廣州醫(yī)藥站化學(xué)試劑公司），蔗糖（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），CuSO4（分析純，上海試一化學(xué)試劑有限公司），檸檬酸鈉（分析純，中國(guó)上海試劑一廠），無(wú)水Na2CO3（分析純，南京化學(xué)試劑一廠），KI（化學(xué)純，南京化學(xué)試劑有限公司），Na2HPO4·2H2O（分析純，江蘇省連云港市化學(xué)試劑廠），濃HCl（分析純，南京化學(xué)試劑有限公司），NaOH。2.1.2配制試劑①唾液淀粉酶的制備：用燒杯取蒸餾水或自來(lái)水，含于口中，1—2分鐘后，吐入50mL燒杯中，備用。②Benedict試劑A、取CuSO417.3g溶于100mL熱蒸餾水中，冷后稀釋至150mL；B、取檸檬酸鈉173g及無(wú)水Na2CO3100g，加水600mL加熱使之溶解，冷后稀釋至850mL；1C、將A液緩慢注入B液中，混勻備用。（可長(zhǎng)期保存）。③pH1.5溶液：取0.2MNa2HPO4·2H2O溶液41.2mL加入0.1M檸檬酸鈉38.8mL，然后用濃HCl調(diào)至pH1.5左右；④pH6.8溶液：取0.2MNa2HPO4·2H2O溶液61.8mL加入0.1M檸檬酸鈉18.2mL；取0.2MNa2HPO4·2H2O溶液77.8mL加入0.1M檸檬酸鈉2.2mL，然后用⑤pH9.8溶液：0.1MNaOH調(diào)至pH9.8左右；⑥0.3%NaCl的0.5%的淀粉液：稱取可溶性淀粉1.25g、NaCl0.75g于燒杯中，加入200mL水，于電爐上加熱，邊加熱邊用玻璃棒攪拌，直至液體澄清。待冷卻后轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶，定容。⑦0.5%的蔗糖溶液：稱取蔗糖0.5g，加水溶解，定容至100mL。稱取碘化鉀3g溶于蒸餾水中，待全部溶解后再加I1g，振蕩溶解，定容⑧KI-I溶液：至100mL。2.1.3儀器試管（10支）移液管（7支）大燒杯（1000ml）HW·YS型電子恒溫水浴（37℃）石棉網(wǎng)洗耳球玻璃棒膠頭滴管，小燒杯（50，100ml）BP221S型電子天平pH試紙，容量瓶試管架2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1酶的特異性（1）取兩支試管編號(hào)①、②，①號(hào)加入0.5%的淀粉液2mL,②號(hào)加入0.5%的蔗糖液2mL；（2）與兩支試管各加入制備好的唾液1mL；（3）將兩支試管同時(shí)放入37℃恒溫水浴鍋中保溫；（4）15分鐘后，取出兩試管，各加入Benedict試劑1mL；（5）將兩試管同時(shí)放入沸水中煮沸6分鐘；（6）取兩支試管，觀察記錄顏色的變化，并注意是否有紅棕色產(chǎn)生。A型50Hz220V—800W雙層鐵皮電爐2表1酶的特異性驗(yàn)證2.2.2溫度對(duì)酶活性的影響①取三支試管并編號(hào)①、②、③，同時(shí)加入5mL0.5%淀粉液及1mL唾液混勻；②將管①、管②、管③同時(shí)分別放入冰浴、37℃水浴、沸水浴中；③15分鐘后，取出各管，分別加入碘液數(shù)滴，觀察并記錄各管顏色變化。表2溫度對(duì)酶活性的影響2.2.3pH對(duì)酶活性的影響①取試管3支編號(hào)6、7、8，按下表加入試劑；②3支試管同時(shí)放入37℃恒溫水浴鍋內(nèi)保溫；③15分鐘后，取出3支試管，分別加入碘試劑數(shù)滴，每加一滴，注意搖勻，觀察并記錄顏色變化。表3pH對(duì)酶活性的影響33結(jié)果與分析3．1實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1.1酶的特異性實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象：①號(hào)試管經(jīng)沸水浴后，試管內(nèi)顏色仍為藍(lán)色，但在試管底部可以看出有些許磚紅色沉淀出現(xiàn)；②號(hào)試管經(jīng)沸水浴后顏色沒(méi)有發(fā)生變化(仍為淺藍(lán)色。（如圖1）②號(hào)試管①號(hào)試管圖1酶的特異性實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象表明：唾液淀粉酶能水解淀粉，而不能水解蔗糖。說(shuō)明唾液淀粉酶具有特異性。3.1.2溫度對(duì)酶活性的影響實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象：①號(hào)試管加5滴碘液并混勻后顏色趨近與碘液原來(lái)的顏色，但較②號(hào)試管顏色較深；②號(hào)試管加5滴碘液并混勻后也趨近碘液本身顏色，但比碘液顏色淺；③號(hào)試管加5滴碘液并混勻后變成深藍(lán)紫色。（如圖2）。①②③圖2溫度對(duì)酶活性的影響實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象表明：經(jīng)過(guò)冰水浴后，唾液淀粉酶活性降低，但仍能將淀粉分解成葡萄糖；而在37℃條件下唾液淀粉酶活性較高，將淀粉分解成葡萄糖。說(shuō)明低溫對(duì)唾液淀粉酶活性有一定影響。經(jīng)過(guò)沸水浴后，唾液淀粉酶變性，不能分解淀粉。3.1.3pH對(duì)酶活性的影響實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象：①號(hào)試管逐滴加入3滴碘液并混勻后變成酒紅色；②號(hào)試管逐滴加入3滴碘液并混勻后接近碘液本身的顏色；③號(hào)試管逐滴加入3滴碘液并混勻后變成淺藍(lán)黃色。（如圖3）。4①②③圖3pH對(duì)酶活性的影響實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象表明：pH為1.5（強(qiáng)酸性）條件下，唾液淀粉酶可以水解淀粉；pH為6.8（接近中性）條件下，唾液淀粉酶活性較高，能水解淀粉；pH為9.8（堿性）條件下，唾液淀粉酶仍能水解淀粉，只是較pH1.5和pH9.8相比，酶的活性較弱。3.2結(jié)果分析本實(shí)驗(yàn)研究酶的特異性及溫度、pH對(duì)酶活性的影響得到以下結(jié)果：唾液淀粉酶只能水解淀粉而不能水解蔗糖，驗(yàn)證了酶的特異性，與理論相符。在溫度對(duì)酶活性影響實(shí)驗(yàn)中，由顏色變化可以得出結(jié)論：高溫降低酶活性，低溫對(duì)酶活有較小的抑制作用。在pH對(duì)酶活性影響實(shí)驗(yàn)中，得出的結(jié)論是：高pH對(duì)酶活抑制較大，低pH對(duì)酶活抑制較小。4討論從實(shí)驗(yàn)中可以得出結(jié)論：唾液淀粉酶具有高度特異性，其活性受溫度、pH值等多種因素影響。但本組實(shí)驗(yàn)所得磚紅色沉淀較少，有些實(shí)驗(yàn)組沒(méi)有沉淀產(chǎn)生，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)與預(yù)期不一的原因是由于唾液淀粉酶含量存在明顯的個(gè)體差異，因而為了確定恰當(dāng)?shù)耐僖合♂尡稊?shù)和反應(yīng)時(shí)間，建議在原實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目之前增加唾液稀釋倍數(shù)確定實(shí)驗(yàn)。唾液淀粉酶活性存在明顯的性別差異[1]和個(gè)體差異，不同個(gè)體的酶活性相差達(dá)到上百倍，其主要是由于編碼該酶的基因在體內(nèi)的拷貝數(shù)差異所決定的[2-3]在進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中會(huì)發(fā)現(xiàn)不同同學(xué)的唾液淀粉酶活力不同，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用的唾液的稀釋倍數(shù)也不同。本實(shí)驗(yàn)探究溫度對(duì)酶活性影響的結(jié)論與預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果有差異，且發(fā)現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)證明酶的活性在沸水浴(95℃)中并沒(méi)有受到影響，反而比恒溫水浴(37℃)反應(yīng)的更徹底[4]；本實(shí)驗(yàn)探究溫度對(duì)酶活性影響的結(jié)論與預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一，需要改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方案：不要檢測(cè)反應(yīng)物(淀粉)，用斐林試劑檢測(cè)產(chǎn)物(還原糖)進(jìn)行判斷，且注意斐林試劑的用量為5%HCl用量的2倍[5]。因此，要進(jìn)一步探究溫度、pH對(duì)酶活性的影響，確定酶的最適溫度和最適pH，需要更加嚴(yán)格周密的實(shí)驗(yàn)方案。55參考文獻(xiàn)[1]歸改霞.性別不同對(duì)唾液淀粉酶活性影響的研究.衛(wèi)生職業(yè)2013,31(24):110-11[2]PerryGH,DominyNJ,ClawKG,etal.Dietandtheevolutionofhumanamylasegenecopynumbervariation[J].NatGenet,2007,39:1256-1260.[3]MandelAL,PeyrotdesGachonsC,PlankKL,etal.IndividualDifferencesinAMY1genecopynumber,salivarya-amylaselevelsandtheperceptionoforalstarch[J].PLoSONE,2010,5:13352.[4]馬彥玲.不同溫度影響唾液淀粉酶活性實(shí)驗(yàn)操作流程的再改進(jìn).河南職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2013,25(5):613-616[5]范淑秋.pH影響淀粉酶活性的探究.生物學(xué)通報(bào),2008,43(10):49-506血紅蛋白凝膠過(guò)濾層析班級(jí)：生技121【摘要】本實(shí)驗(yàn)利用SephadexG－25制備凝膠柱，通過(guò)凝膠過(guò)濾層析的方法，從新鮮雞血中制備雞的血紅蛋白，經(jīng)洗脫液不斷洗脫最終收集到含有雞血紅蛋白的樣液?！娟P(guān)鍵詞】凝膠過(guò)濾層析，血紅蛋白,分離純化1前言分離和提純蛋白質(zhì)方法多種多樣，其中最為重要的兩種方法就是電泳和層析，在這些方法中主要是利用蛋白質(zhì)之間各種特性的差異，包括分子的大小和形狀、酸堿性質(zhì)、溶解度、吸附性質(zhì)和對(duì)其他分子的生物學(xué)親和力[1]。凝膠過(guò)濾是一種利用凝膠按照分子大小分離物質(zhì)的層析方法，又稱分子排阻層析、分子篩層析等,它是利用某些化學(xué)惰性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)(凝膠)為填料,通過(guò)洗脫液的連續(xù)洗脫,使混合物中的各種物質(zhì)按其分子體積大小和形狀的差異而得到分離,已廣泛應(yīng)用于大分子物質(zhì)的去鹽、溶液的濃縮、分離提純及分子量測(cè)定等方面[2]。凝膠過(guò)濾層析具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、分離迅速和不影響樣品生物活性等優(yōu)點(diǎn),但凝膠過(guò)濾層析對(duì)蛋白混合物的最佳分離效果受許多因素的影響。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的學(xué)習(xí)，了解凝膠柱層析的原理及應(yīng)用，掌握凝膠柱層析的基本操作技術(shù)，為進(jìn)一步掌握離子交換柱層析、親和層析及吸附層析等其它分離方法打下良好基礎(chǔ)。2材料與方法2.1材料2.1.1實(shí)驗(yàn)材料新鮮雞血Na2HPO4·2H2O（分析純，江蘇省連云港市化學(xué)試劑廠）；NaH2PO4·2H2O（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；蒸餾水；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA－Na2）（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）（分析純，江蘇徐州試劑二廠）；SephadexG－25；固體鐵氰化鉀〔K3Fe（CN）6〕；檸檬酸鈉（分析純，中國(guó)上海試劑一廠）2.1.3配置試劑7姓名：牛軍學(xué)號(hào)：201212111112.1.2藥品①磷酸緩沖液（pH7.0）：稱取Na2HPO4·2H2O2.172g，NaH2PO4·2H2O1.076g，溶于蒸餾水中，定容至1000mL。②Na2HPO4—EDTA—Na2溶液：稱取2.69gEDTA—Na2，3.56gNa2HPO4·2H2O，加蒸餾水溶解并定容至100mL。③40mmol/LFeSO4溶液：稱取FeSO4·7H2O1.11g溶于100mL水中（現(xiàn)配現(xiàn)用）。①凝血：添加抗凝劑（150g/LEDTA.k2）的新鮮雞血2.1.4儀器BP221S型電子天平玻璃棒洗耳球2.2方法2.2.1凝膠溶脹[3]取10gSephadexG－25，加200mL蒸餾水充分溶脹。待凝膠溶脹平衡后，用傾瀉法除去細(xì)小顆粒，再加入與凝膠等體積的pH7.0磷酸緩沖液，在真空干燥器中減壓除氣（過(guò)夜），準(zhǔn)備裝柱。2.2.2裝柱將層析柱垂直固定，旋緊柱下端的螺旋夾，在柱內(nèi)加入少量磷酸緩沖液或直接把處理好的凝膠連同適當(dāng)體積的緩沖液用玻棒攪勻，然后邊攪拌邊倒入層析柱中，同時(shí)開(kāi)啟螺旋夾，控制一定流速。裝柱后形成的凝膠床長(zhǎng)約20cm，使膠床表面保持2-3cm液層。2.2.3平衡繼續(xù)用磷酸緩沖液洗脫，調(diào)整緩沖液流速，平衡20-30分鐘。2.2.4樣品制備（1）取1mL雞的抗凝血放入小燒杯中，加5mLpH7.0的磷酸緩沖液，再加入27.5mgK3Fe(CN)6固體，用玻棒攪動(dòng)使其溶解，即得褐色的高鐵血紅蛋白溶液。（2）吸取lmLFeSO4溶液和lmLEDTA-Na2-NaHPO4溶液，于小燒杯中混勻。2.2.5上樣旋開(kāi)層析柱上端旋扭，待膠床上部的緩沖液幾乎全部進(jìn)入凝膠（即緩沖液液面與膠床平面相切）時(shí)，立即加入0.4mL上述混合液，待其進(jìn)入膠床表面僅留約lmm液層時(shí)，加入0.5mL緩沖液，再當(dāng)膠床表面僅留約lmm液層時(shí)，吸取0.5mL血紅蛋白樣品溶液，小心地注入層析柱膠床面中央。慢慢打開(kāi)螺旋夾，待大部分8層析柱（Φ1cm×20cm）燒杯（50ml,100ml,500ml）移液管（1mL，5mL，10ml）容量瓶（100ml,1000ml，2000ml）膠頭滴管樣品進(jìn)入膠床、床面上僅有l(wèi)mm液層時(shí)，用乳頭滴管加入少量緩沖液，使剩余樣品進(jìn)入膠床，然后用液管小心加入3—5cm高的洗脫緩沖液。2.2.6洗脫繼續(xù)用磷酸緩沖液洗脫，調(diào)整流速，使上下流速同步保持每分鐘約6滴。等有紅色液體滴出時(shí)開(kāi)始收集液體，直至滴出液體顏色變淺。2.2.7凝膠的回收。實(shí)驗(yàn)完畢用洗脫液把柱內(nèi)有色物質(zhì)洗脫干凈，保留凝膠柱重復(fù)使用。3結(jié)果與分析3.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果凝膠經(jīng)溶脹、裝柱、沉降后形成膠床，用磷酸緩沖液平衡后，沿層析柱內(nèi)壁加入FeSO4、EDTA-Na2-NaHPO4混合溶液，等其進(jìn)入膠后往膠床面中央加入雞血血紅蛋白，等其進(jìn)入膠床后加入磷酸緩沖液。血紅蛋白在膠床中緩慢層析，分為三層：上層呈現(xiàn)黃色，是鐵氰化鉀；中層呈現(xiàn)暗紅色，是雞血中的小分子物質(zhì)及少量血紅蛋白；最下層呈現(xiàn)鮮紅色。收集層析柱中的紅色的液體部分即為血紅蛋白。本次實(shí)驗(yàn)收集的血紅蛋白的量大約2mL。3.2結(jié)果分析本次實(shí)驗(yàn)中，層析的樣品在膠床內(nèi)分三層，符合理論；在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，樣品洗脫速度較為合適，流速基本控制在每分鐘6滴，洗脫獲得的血紅蛋白較其他實(shí)驗(yàn)組顏色略淺，總體而言，本實(shí)驗(yàn)是比較成功的，但在一些方面仍需要改進(jìn)：成功之處：①層析速度控制準(zhǔn)確，樣品的條帶清晰，分層清楚；②層析過(guò)程中操作規(guī)范，加樣準(zhǔn)確，層析結(jié)果較好。不足之處：①配制FeSO4溶液時(shí)，由于操作不及時(shí)，導(dǎo)致FeSO4被氧化，進(jìn)而重新配制；9②有血紅蛋白層析出時(shí)未能及時(shí)收集，導(dǎo)致部分血紅蛋白損失。③層析后的柱子污染較為嚴(yán)重，抗凝血在層析前能離心處理下最好。④實(shí)驗(yàn)后，沒(méi)有保持柱子處于緩沖體系中，出現(xiàn)柱子變干的情況。4討論凝膠層析主要根據(jù)被測(cè)樣品分子量的差異,在固定相上受到阻滯程度不同而達(dá)到分離的目的。分子量大的物質(zhì)隨流動(dòng)相移動(dòng)速度較快,先流出層析床。反之,分子量小的物質(zhì)移動(dòng)速度較慢,后流出[4]。凝膠過(guò)濾層析的操作條件比較溫和，可在相當(dāng)廣的溫度范圍下進(jìn)行，葡聚糖凝膠的吸附力弱，不需要有機(jī)溶劑，并且對(duì)分離成分理化性質(zhì)的保持有獨(dú)到之處。對(duì)于高分子物質(zhì)有很好的分離效果，也可用于去除高分子物質(zhì)（如核酸、蛋白質(zhì)、多糖等）中的一些小分子雜質(zhì)。測(cè)定已知分子量的物質(zhì)通過(guò)凝膠過(guò)濾層析洗脫體積，再測(cè)定未知分子量的大分子物質(zhì)體積，從而測(cè)定高分子物質(zhì)的分子量。鑒于凝膠層析法的高分離率、高靈敏度及操作簡(jiǎn)單,保持樣品的生物活性等優(yōu)點(diǎn),這種方法已廣泛應(yīng)用于大分子物質(zhì)的去鹽、溶液的濃縮、分離提純及分子量測(cè)定。5參考文獻(xiàn)[1]史偉，禹婷.蛋白質(zhì)的層析分離內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技,2011（1）：110-112[2]方福德,周呂,丁濂,等.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技巧全書(shū)[M].北京:北京醫(yī)科大學(xué)中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,1995[3]王璞,林紅,朱濱.凝膠過(guò)濾層析實(shí)驗(yàn)中Sephadex的溶脹與回收保存.中國(guó)科技論文統(tǒng)計(jì)源期刊,2006,23(2):24-25[4]楊歌德,姜玉梅,周宏博.凝膠過(guò)濾層析分離蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)中三種過(guò)濾介質(zhì)分離效果的比較.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2002,36(3):242-24310SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳—蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定班級(jí)：生技121【摘要】本實(shí)驗(yàn)利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定凝膠過(guò)濾分離的雞血血紅蛋白的分子量。通過(guò)電泳后的條帶計(jì)算樣品遷移率，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線，估算血紅蛋白分子量。【關(guān)鍵詞】SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，血紅蛋白，分子量1前言SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳是一種用作測(cè)定蛋白質(zhì)分子量常用的生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法。它的基本原理是SDS與蛋白質(zhì)分子結(jié)合,形成復(fù)合物。而且各種蛋白-SDS復(fù)合物在凝膠電泳中的遷移率只與蛋白質(zhì)的分子量有關(guān)系。用這種方法測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量,操作簡(jiǎn)便,快速,所需設(shè)備廉價(jià),所得結(jié)果在分子量為15kD-200kD的范圍內(nèi),與用其他方法測(cè)得的分子量相比,誤差一般在正負(fù)10%以內(nèi)[1]:聚丙烯酰胺凝膠是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),具有分子篩效應(yīng),可以根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的不同而分離蛋白質(zhì)。電泳時(shí),分子量小的蛋白質(zhì)跑得快在下面,而分子量大的蛋白質(zhì)跑得慢在上面SDS在蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域有著重要作用。2材料與方法2.1材料雞血血紅蛋白2.1.1試劑SDS（十二烷基硫酸鈉）（化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）丙烯酰胺（Acr）（化學(xué)純，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司）N,N’甲叉雙丙烯酰胺（Bis）（化學(xué)純，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司）Tris（化學(xué)純，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司）甘氨酸（Gly）（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）NaH2PO4（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）Na2HPO4（分析純，江蘇省連云港市化學(xué)試劑廠）考馬斯亮藍(lán)R—250（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）50%甲醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）冰乙酸（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）蒸餾水過(guò)硫酸銨（化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）HCl（分析純，南京化學(xué)試劑有限公司）巰基乙醇（化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）甘油（分析純，宜興市鈕家化學(xué)試劑廠）溴酚藍(lán)（分析純，上海化學(xué)試劑總廠）11姓名：牛軍學(xué)號(hào)：20121211111四甲基乙二胺（TEMED）（化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）2.1.2配置試劑①10%過(guò)硫酸銨：稱取1.002g過(guò)硫酸銨固體粉用蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用蒸餾水定容。②凝膠注液：稱取Acr29g，Bis1g于燒杯中，然后加蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線，蓋上瓶塞倒轉(zhuǎn)搖勻。③樣品溶解液：SDS4.02g，巰基乙醇0.4mL，甘油4mL，溴酚蘭0.01g，pH7.2磷酸緩沖液2mL。加蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移至1000mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線，蓋上瓶塞倒轉(zhuǎn)搖勻。④4X濃縮膠buffer：稱取Tris6.0153g,用HCl調(diào)pH到6.8，然后加入SDS0.4070加水至100mL。⑤4X分離膠buffer：稱取Tris36.3598g,用80mL蒸餾水溶解，再用濃HCl調(diào)pH到8.8，然后加入SDS0.808g，60℃水浴溶解，加蒸餾水至200mL。⑥電泳buffer：稱取Tris12.1875g，Gly57.748g和檸檬酸4.0149g,放入到500mL大燒杯中，加蒸餾水60℃水浴溶解，轉(zhuǎn)移至2000mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度線，蓋上瓶塞倒。⑦0.2mol/L，pH7.2磷酸鹽緩沖溶液：取280mol/L.0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液，加入720mL0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液，混勻后在pH計(jì)上調(diào)至pH7.2。⑧染色液：稱取0.25g考馬斯亮藍(lán)R-250，454mL50%甲醇，46mL冰乙酸于燒杯中，轉(zhuǎn)移至500mL容量瓶中。⑨脫色液：75mL冰乙酸，875mL蒸餾水與50mL甲醇混合。2.1.3儀器DYC2-24D型垂直板型電泳槽；移液管（1mL、5mL、10mL）；微量進(jìn)樣器（50μL）；培養(yǎng)皿（直徑120mm）；電吹風(fēng)；DYY-2C型直流穩(wěn)壓電泳儀；燒杯（25mL、50mL、100mL）；細(xì)長(zhǎng)滴管；手術(shù)刀片；電爐。122.2方法2.2.1安裝垂直板電泳槽、凝膠制備先把垂直平板電泳槽和兩塊玻璃板洗凈，晾干。這種電泳槽兩側(cè)為有機(jī)玻璃制成的電極槽，兩個(gè)電