生技11發(fā)酵實驗方案

1113發(fā)酵試驗方案〔細菌〕原理：利用京尼平苷經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解后產(chǎn)生京尼平與谷氨酸反響生成藍色。通過平板顏色變化來推斷是否存在產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株。材料與儀器：主要儀器設備：250ml三角瓶、培育皿、移液管、移液槍、移液槍盒、藍蓋瓶、涂布棒、接種環(huán)〔針、1000ml燒杯、100ml燒杯、玻璃棒、離心管、高壓滅菌鍋、鑷子原料與藥品：梔子、谷氨酸、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、氯化鈉培育基：分別篩選培育基：牛肉膏蛋白胨培育基 鑒定培育基：牛肉膏蛋白胨培育基+梔子+谷氨酸試驗方法：β-葡萄糖苷酶的菌株篩選富集培育〔初篩〔牛肉膏蛋白胨培育基：試驗預備：收集產(chǎn)酶菌株可能存在的樣品：中藥港采集穎土樣、梔子在土里培育發(fā)霉的土樣儀器滅菌：將培育皿、移液管、涂布棒、移液槍頭、蒸餾水等滅菌煮梔子浸提液：的濾液混合，濾液收集體積與梔子稱量的量為10:1。配制牛肉膏蛋白胨培育基按培育基配方稱好，瓊脂，加熱溶化，分裝，121攝氏度高壓滅菌20min，倒平板。用梯度稀釋法來分別產(chǎn)生菌：5g45mL5min，制成土壤懸液，此時10-1。另取7支試離心管，分別記作10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-889mL1mL土壤懸液，10-21mL10-2離心管中，依此類推直至10-710-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8七個稀釋度的離心管中吸100uL懸液，均勻涂布于分別培育基平板上，于30℃培育。24h后觀看現(xiàn)象。復篩、鑒定培育基復篩稱取谷氨酸〔培育基的1%，在超凈工作臺滅菌20min〕參加到牛肉膏蛋白胨培育基中充分溶解，吸取梔子浸提液〔10%〕到培育基中搖勻，倒平板。將上述富集培育的菌種涂布或劃線或點種到鑒定培育基上，培育24h后觀看變色圈。、分別純化將有透亮圈的菌株挑出分別純化試驗二、菌種的保藏和活化一、目的和要求1、了解各種保藏方法的優(yōu)缺點及其適用的目標微生物。2、學習并把握幾種常用的微生物菌種保藏方二、試驗原理保藏微生物菌種的目的不僅要保存菌株的生命本身狀態(tài)的孢子或芽孢而進展；而從環(huán)境條件來說，就是要選用低溫、枯燥和缺氧等三個條。三、試驗材料純化好的目的菌種、40﹪甘油、EP管四、試驗步驟140mL試劑級丙三醇，再加蒸餾水60mL，搖勻，即為40%甘油溶液。將配置好的甘油溶液放于25mL的三角瓶中塞好棉塞，用紗布，牛皮紙包扎好，1-5mL0.1±0.05Mpa，120±21-1.5小時，3-534±0.524-485%做無菌試驗，確定無菌方可使用。2、菌種保藏：取第三代純化的菌種平板，用無菌水將目的菌洗下，用移液槍將其移入帶有15min40﹪1:1的比例放入EP管中，放入-20℃冰箱中保藏。五、菌種復活從冰箱中取出EP管進展解凍，解凍后在超凈工作臺中將保藏菌種接種于倒好培育基的平板中，首先每個EP100ml菌液接種于平板中，每個管接一個平板，然后將接種好的平30℃的培育箱中進展培育，最終觀看菌種的生長狀況。試驗三葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的誘變一、菌懸液的制備10mL的0.9%無菌生理鹽水移入牛肉膏蛋白胨培育基斜面菌種中洗脫菌種，然后經(jīng)過490mL生理鹽水的錐形瓶中，于磁力攪拌器上攪拌10min，使菌種完全分散，制成不同菌濃度的菌懸濁液，備用。二、紫外誘變選育高產(chǎn)菌株承受功率為15W,照耀距離為20cm,分別對一樣濃度和體積的菌懸液進展輻射處理,照耀時間分別為40、80、120、160、200、240、280、320、360、400、440、480s,將處理過的菌懸液作梯度稀釋,涂布于平板培育基上,80%～90%的誘變劑量處理菌懸液,處理后涂布于篩選平板培育基〔改進牛肉膏蛋白胨培育基，含10%梔子液及谷氨酸〕上培育,依據(jù)變色圈的大小選育出產(chǎn)量高的菌株。致死率=(比照菌落數(shù)-處理菌落數(shù))/比照菌落數(shù)×100%。三、超聲波誘變選育高產(chǎn)菌株承受20kHz200W的超聲波條件,分別對一樣濃度和體積的菌懸液進展輻射處理1020、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120s,將處理過的菌懸液作梯度稀釋,涂布于平板培育基上,培育后計算致死率。以致死率在80%～90%的誘變劑量處理菌懸液,處理后涂布于篩選平板培育基上培育,依據(jù)變色圈的大小選育出產(chǎn)量高的菌株。四、微波誘變選育高產(chǎn)菌株承受脈沖頻率為2450MHz，功率為800W的微波爐，分別對一樣濃度和體積的單孢子懸液進行輻射處理。每次照耀30s后使平皿冷卻，再進展照耀，并將照耀時間累計。設定不同的輻射時間為不同的微波處理劑量，一樣條件非輻射菌懸液平板培育，計算致死率：致死率=〔比照菌落數(shù)-處理菌落數(shù)〕/比照菌落數(shù)×100%90%基上培育,依據(jù)變色圈的大小選育出產(chǎn)量高的菌株。留意：12、紫外誘變要在沒有照顧的狀況下進展，誘變后的培育也在黑暗的狀況下培育〔可用黑色塑料袋包好后，置于培育箱培育〕。試驗四、發(fā)酵條件的優(yōu)化確定試驗室發(fā)酵工藝。(一) 培育基成分1、斜面培育基：牛肉膏蛋白胨固體培育基2、種子培育基：牛肉膏蛋白胨固體培育基液體培育基3、發(fā)酵培育基牛肉膏蛋白胨固體培育基液體培育基(二) 試驗方法1、菌種的復活：將菌種在無菌條件下接入斜面培育基中，3024小時.2、種子培育：將斜面菌株接種到種子培育基中,3024小時.310%接種量接人到發(fā)酵培育基(250mL25mL培育液,121℃滅菌20分鐘),30℃,180轉(zhuǎn)／分,72時,取動身酵液,4000rpm/min離心10分鐘,收集上清液,測轉(zhuǎn)化率。5液體發(fā)酵培育基的優(yōu)化不同碳源對轉(zhuǎn)化率的影響：分別以麩皮，玉米粉，蔗糖，淀粉，麥芽糖為碳源，發(fā)酵培育，測酶活，選著最正確碳源，在以不同濃度優(yōu)化.發(fā)酵培育，測酶活，選著最正確氮源，再以不同濃度優(yōu)化.磷酸鹽對轉(zhuǎn)化率的影響：分別在發(fā)酵培育基中參加0，0.1%、0.2%，0.3%，0.4%，0.5%，0.6%的磷酸鉀進展優(yōu)化發(fā)酵起始PH優(yōu)化;將起始PH4，5,6,7,8進展發(fā)酵，選著最適PH值。正交試驗確定最正確轉(zhuǎn)化率條件.6發(fā)酵條件的優(yōu)化發(fā)酵溫度的優(yōu)化：發(fā)酵溫度分別掌握在26℃,28℃,30℃,32℃，34℃下培育，選著最適發(fā)酵培育溫度。搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化;140ｒ/miｎ,160ｒ/miｎ,180ｒ/miｎ,200ｒ/miｎ,220ｒ/miｎ下發(fā)酵培育，選著最正確轉(zhuǎn)速。接種量的優(yōu)化：接種量分別為5%，10%，15%，發(fā)酵培育，選著最正確接種量.3,4，5,6,7,8,9天，測轉(zhuǎn)化率，選著最正確發(fā)酵時間.裝液量的優(yōu)化：分別裝25ｍｌ,40ｍｌ,55ｍｌ,70ｍｌ,85ｍｌ,100ｍｌ培育基，進展發(fā)酵培育，選擇最正確裝液.京尼平的測定方法一、試劑配制：一〔0.2mg/m20毫克精氨酸溶解后定溶于100二、操作步驟;1、用無菌水沖洗斜面孢子，并用接種環(huán)不斷刮斜面以使孢子懸浮充分。將其接種到加有肯定量梔子浸提液〔如：終濃度2%、5%〕的發(fā)酵培育基中，30℃，150r/min震蕩培育3d30℃，150r/min3d〔留意：假設做不同梔子量的培育基水尋常，要記得有針對的空白比照。如2%和5%有各自對應。2、取動身酵液，40000rpm/min10分鐘，收集上清液即為京尼平樣品溶液。32.0ml于試管中，參加2.0ml精氨酸