抗腫瘤藥物篩選

抗腫瘤藥物篩選第一頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期六抗腫瘤藥物篩選

是新藥發(fā)現(xiàn)與開發(fā)的重要環(huán)節(jié).通常是指從樣品到活性檢測至動物實驗療效各個階段的工作.一般常用以下幾種方法:1.腫瘤細胞組織培養(yǎng)篩選方法2.微生物學(xué)篩選方法Antitumordurgscreening。第二頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期六1.腫瘤組織細胞培養(yǎng)篩選方法細胞培養(yǎng)法是篩選抗腫瘤藥物比較常用的一種方法.它包括人體腫瘤細胞和動物腫瘤細胞,培養(yǎng)方法包括單層細胞培養(yǎng)、瓊脂平板培養(yǎng)、細胞集落培養(yǎng)、組織塊培養(yǎng)、器官培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)等.觀察藥物活性的方法包括細胞形態(tài)、分裂相計數(shù)、脫氫酶活性、細胞染色、呼吸測定、熒光顯微鏡下染色反應(yīng)、核酸蛋白質(zhì)等生化測定以及同位素技術(shù)等.第三頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期六當前,體外抗腫瘤活性實驗選用人癌細胞株,按常規(guī)細胞培養(yǎng)法進行培養(yǎng),使用四氮唑藍(MTT)還原法,磺羅丹明B染色法或集落形成法等測定藥物抗癌作用.本實驗除了用于抗腫瘤藥物的初步篩選外,還用于了解候選化合物的抗瘤譜,為隨后進行體內(nèi)抗腫瘤實驗(如劑量范圍.腫瘤類別等)提供參考.第四頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期六2.微生物學(xué)篩選方法盡管利用癌細胞體外培養(yǎng)作為抗腫瘤藥物的篩選模型要比利用微生物模型篩選出的體內(nèi)有效的抗腫瘤藥物的命中率更大,但基于微生物生長與動物細胞代謝有這不少共同點,加上微生物學(xué)方法簡便,適合大量天然產(chǎn)物的初篩,因此,微生物學(xué)方法一直為國內(nèi)外試驗室所采用.第五頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期六噬箘體法

噬菌體(bacteriophage,phage)是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱，因部分能引起宿主菌的裂解，故稱為噬菌體。本世紀初在葡萄球菌和志賀菌中首先發(fā)現(xiàn)。噬菌體具有病毒的一些特性：個體微小。噬菌體基因組含有許多個基因，但所有已知的噬菌體都是細菌細胞中利用細菌的核糖體、蛋白質(zhì)合成時所需的各種因子、各種氨基酸和能量產(chǎn)生系統(tǒng)來實現(xiàn)其自身的生長和增殖。一旦離開了宿主細胞，噬菌體既不能生長，也不能復(fù)制。

第六頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期六第七頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期六噬箘體第八頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期六噬箘體的兩種類型噬菌體有毒（烈）性噬菌體和溫和噬菌體兩種類型。侵入宿主細胞后，隨即引起宿主細胞裂解的噬菌體稱作毒性噬菌體。毒性噬菌體被看作正常表現(xiàn)的噬菌體。溫和噬菌體則是：當它侵入宿主細胞后，其核酸附著并整合在宿主染色體上，和宿主核算同步復(fù)制，宿主細胞不裂解而繼續(xù)生長。這種不引起宿主細胞裂解的噬菌體稱作溫和噬菌體.也即溶原性細菌.第九頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期六★噬箘體法包括抗噬箘體法和溶原性菌誘導(dǎo)法兩種.細菌的噬箘體核酸大部分為雙鏈DNA,干擾DNA代謝的抗生素(如放線菌素.博來霉素)常也抑制噬箘體在細菌細胞內(nèi)的生長,從而出現(xiàn)抗噬箘體現(xiàn)象.T4噬箘體吸附在大腸桿菌細胞第十頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期六第十一頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期六應(yīng)用誘導(dǎo)溶源性菌前噬箘體的方法篩選.溶源性菌的噬箘體DNA基因組直接螯合到細菌染色體DNA,不復(fù)制,因為大部分基因功能收到了“阻遏物”抑制,但當活性“阻遏物”的量由于細胞內(nèi)或環(huán)境因子(物理的化學(xué)的)而降低時,溶源性就不能維持,前噬箘體就與染色體離開,進入自己的生長周期,又產(chǎn)生成熟的具感染性的噬箘體使細胞裂解,這種現(xiàn)象即為誘導(dǎo)作用.第十二頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期六★細菌變種法利用細菌為材料來篩選抗腫瘤抗生素主要有兩種方法.一類是人工培養(yǎng)變種,使細菌有一定的代謝特征.如使細菌糖酵解代謝增強等,或誘變生化變株,使細菌模仿腫瘤細胞的某種代謝特點或者使其對核酸或蛋白質(zhì)合成的抑制劑有高度的敏感性.另一類是檢測突變作用,由于抗腫瘤藥物能使某些微生物產(chǎn)生突變作用,例如用依賴鏈霉素菌株來篩選藥物,如果使依賴鏈霉素菌株誘變?yōu)椴灰蕾囨溍顾?那么就有可能具有抗腫瘤作用.第十三頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期六★抗代謝法抗代謝物在含無機氮源的合成培養(yǎng)基中顯示抗癌作用,而在普通有機氮源的營養(yǎng)培養(yǎng)基中無抗癌作用.利用這個特點,選擇無機氮源實驗有抗菌作用的物質(zhì),作為抗代謝的初篩方法.第十四頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期六★精原細胞法1.建立精原細胞法的依據(jù)造精過程可分為下列階段:A型精原細胞、B型精原細胞、靜止期初級精母細胞、初級精母細胞(細線期.偶線期.粗線期.雙線期.終變期)、次級精母細胞、精子細胞(園核精子細胞.長核精子細胞)、精子.在造精細胞系列中,對放射最為敏感的是B型精原細胞,其次是A型精原細胞,然后依次為精子細胞、精母細胞、精子.第十五頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期六精原細胞法陽性和抗腫瘤作用的相關(guān)性尤以在抗生素和植物藥中較為明顯.用精原細胞法檢測72種抗生素,精原細胞法陽性的13種抗生素,據(jù)已報道資料均屬抗腫瘤抗生素,其中9種在臨床上有一定療效.精原細胞法陰性的59種抗生素中,除又霉素、滅胞素、環(huán)己烯亞胺、螺旋霉素據(jù)報道在動物實驗有抗腫瘤活性外,其他55種均未見報道有抗腫瘤作用.在陰性的59種中,全部未見報道對腫瘤有臨床療效.表明精原細胞法檢測結(jié)果與體內(nèi)實驗抗腫瘤作用有較好的相關(guān)性.第十六頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期六抗腫瘤藥物篩選的分子靶點、當前用于抗腫瘤藥物篩選的靶點種類繁多.主要有細胞周期調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞死亡通路、耐藥性侵襲轉(zhuǎn)移、血管生成等.1.抑制血管生成的篩選模型

★在腫瘤發(fā)生的過程中,當腫瘤的體積超過0.2-2.0mm時,開始建立自己的血液供應(yīng)系統(tǒng),即血管生成,為腫瘤的生長提供物質(zhì)基礎(chǔ).腫瘤新生血管的滋養(yǎng)作用可為腫瘤細胞的生長提供營養(yǎng).氧氣和代謝交換等.而血管內(nèi)皮細胞可通過旁分泌作用產(chǎn)生各種生長因子和刺激因子,如血小板源生長因子、胰島素樣生長因子、以及細胞因子白介素-6.白介素-8等.這些因子能夠誘導(dǎo)刺激腫瘤增殖和遷移.而且,腫瘤細胞與毛細血管形成結(jié)構(gòu)上的密切關(guān)系.此外,腫瘤細胞和血管細胞具有相互作用.一方面血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的各種生長因子和細胞因子對腫瘤生長起到生長刺激作用;另一方面,腫瘤細胞可分泌血管內(nèi)皮細胞生存和增殖所需的有絲分裂原和動力原等.第十七頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期六★抑制血管生成藥物的篩選方法如上所述,血管生成與腫瘤有著密切的聯(lián)系,因此近年來幾種體內(nèi)和體外的分析系統(tǒng)已被用于篩選抑制血管生成藥物.體外分析系統(tǒng)包括血管內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)技術(shù)、血管內(nèi)皮細胞在膠原基質(zhì)上的遷移、血管內(nèi)皮細胞的體外損傷效應(yīng)和凋亡分析等.目前,腫瘤血管生成體內(nèi)研究的生物試驗?zāi)Ｐ椭饕袆游?大鼠,兔等)、眼角膜囊(眼前房)、地鼠頰囊、裸鼠外耳皮下和雞胚絨毛尿囊膜等四種動物模型.第十八頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期六★以端粒酶為靶點的藥物篩選癌細胞的永生化是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵.腫瘤細胞內(nèi)的端粒.端粒酶與此特征有非常重要的關(guān)系.研究資料表明,端粒酶幾乎在人類惡性腫瘤中有不同程度的高表達,其活性檢出率為85﹪-95﹪,而腫瘤周圍的正常組織及良性病變中的檢出率僅為4﹪.而且端粒酶活性與腫瘤的惡性程度,腫瘤的大小,淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移,腫瘤的分級和預(yù)後密切相關(guān).目前,普遍認為端粒酶是一種新的.很有價值的腫瘤標志物.因此,端粒酶已成為抗腫瘤藥物篩選的新靶點.第十九頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期六端粒和端粒酶端粒是真核細胞線性染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu),由一段富含鳥嘌呤(G)的DNA串聯(lián)重復(fù)序列及相關(guān)蛋白質(zhì)組成.具有高度保守性的端粒能夠保護染色體末端免于化學(xué)修飾或被核酶降解,防治染色體復(fù)制時末端粒的長度決定細胞的壽命,隨著細胞分裂的進行,端粒的長度逐漸縮短,當端粒縮短到一定程度即不能維持染色體的穩(wěn)定時,細胞最終死亡.故有人稱端粒為”生命的時鐘”或”有絲分裂的計數(shù)器”.而大多數(shù)腫瘤的端粒長度不隨細胞分裂次數(shù)增加而縮短,具有無限分裂的能力,其原因在于端粒酶的存在.第二十頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期六

端粒酶是一種端粒酶能以自身的RNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄合成端粒DNA序列添加到染色體末端,以補償細胞分裂時端粒DNA的縮短,使細胞克服危機期,成為永生細胞.RNA依賴的

DNA聚合酶,屬于核酸蛋白質(zhì)復(fù)合物,由RNA和蛋白質(zhì)兩種組分構(gòu)成.大多數(shù)體細胞,端粒酶呈非激活狀態(tài).而大多數(shù)腫瘤細胞,端粒酶呈激活狀態(tài).第二十一頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期六以端粒酶為靶點篩選的藥物

按藥物作用機制可分為直接以端粒酶核心組分(RNA部分和催化亞基)為靶標的藥物、以端粒的DNA為靶標的藥物、以端粒和端粒酶蛋白質(zhì)組分為靶標的藥物等.如:通過端粒重復(fù)擴增法證實玉紅霉素及其類似物能抑制人端粒酶活性.如:茶葉中兒茶酚能夠直接強烈地抑制端粒酶活性.第二十二頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期六★細胞凋亡通路的靶點誘導(dǎo)細胞凋亡必要的信號分子是一類絲氨酸蛋白酶,稱為Caspases家族.該家族共有十多個成員,可以彼此之間互相活化形成級聯(lián)反應(yīng).Caspasea活化有多種途徑.1細胞膜通路,是由腫瘤壞死因子(TNF)受體家族介導(dǎo)

2線粒體通路,由線粒體誘導(dǎo)凋亡,

主要靠釋放細胞色素C實現(xiàn).后者可形成活化Caspases的多蛋白復(fù)合體.第二十三頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期六★有關(guān)細胞周期調(diào)控的靶點腫瘤細胞生長的基本特征是細胞失控增殖,其細胞周期及關(guān)卡調(diào)控失常,故細胞周期蛋白依賴性激酶和關(guān)卡激酶可能作為抗腫瘤藥物的靶點.第二十四頁，共二十五頁，編輯于2023年，星期六★與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶點基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移和血管生成有關(guān).