植物表達載體構建與遺傳

植物表達載體構建與遺傳第一頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六

植物基因工程

植物基因工程以植物為對象，將從不同生物中分離到的基因，經(jīng)酶切連接構成重組DNA分子，然后轉(zhuǎn)入受體植物細胞使新基因在受體細胞內(nèi)整合、表達，獲得新的植物類型，再生植株通過無性或有性增殖將外源基因遺傳給后代。

第二頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六植物基因工程的作用與意義

植物基因工程能順利地在不同物種間進行基因轉(zhuǎn)移，因此育種學家可根據(jù)意愿改造植物的一些性狀，在較短時間內(nèi)使獲得高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性強的作物新品種成為現(xiàn)實。

第三頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六

植物基因工程主要研究內(nèi)容

1)

目的基因的克隆與分離；

2)

植物表達載體構建；

3)

建立適宜的遺傳轉(zhuǎn)化再生體系；

4)

遺傳化即轉(zhuǎn)基因；

5)

轉(zhuǎn)化細胞或植物的篩選；

6)

轉(zhuǎn)化植株檢測；

7)

轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境釋放的安全評價。

第四頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六一、植物表達載體構建

第五頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六

構建植物表達載體的目的

構建植物表達載體的主要目的是將目的基因進行修飾改造，使其轉(zhuǎn)入受體植物后的表達符合目的需要。

第六頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六

分離獲得的目的基因往往不具有完整的基因結構，而只是表達產(chǎn)物的可讀框（ORF：openreadingFrame）；還需加上啟動子和終止子。

第七頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六

如果分離到的目的基因擁有完整的基因結構（即擁有啟動子、表達產(chǎn)物的開放閱讀框和終止子），因基因的表達特點不符合要求也需進行修飾改造；有些基因例外，如C4光合代謝途徑的一些關鍵酶基因只能用原基因的所有完整結構才有可能達到目的。

第八頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六

啟動子（promoter）

啟動子是位于基因的5’端外測，緊挨轉(zhuǎn)錄起始位點一段非編碼的核苷酸序列，它的功能是引導RNA聚合酶同基因的正確部位相結合；第九頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六

終止子（terminator）

終止子是在基因3’端下游外測與終止密碼相鄰的一段核苷酸序列，具有轉(zhuǎn)錄終止信號的功能。

第十頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六一）影響構建植物表達載體的主要因素

1)目的基因的結構特點；

2)轉(zhuǎn)化受體植物類型與種類；

3)轉(zhuǎn)化方法；

4)轉(zhuǎn)入受體植物的表達要求；

5)植物表達載體類型；

6)選擇適宜的啟動子與終止子；

7)選擇性標記基因及報告基因；第十一頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六(二）構建植物表達載體的一些基本知識與實驗技能

從事植物表達載體構建工作主要是進行各種質(zhì)粒的提取、純化、酶切、相關DNA片段的回收、連接、轉(zhuǎn)化與驗證等，需要一些分子生物學相關的知識和實驗技能。第十二頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六第十三頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六

常用的基本技能：

1)大腸桿菌、農(nóng)桿菌的培養(yǎng)、繼代與保存；

2)大腸桿菌、農(nóng)桿菌中的質(zhì)粒小量提取、大腸桿菌中質(zhì)粒大量提取與純化；

3)各種質(zhì)粒載體的酶切，回收；

4)大腸桿菌與農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的制備；

5)相關酶切DNA片段的連接與轉(zhuǎn)化；

6)PCR引物設計與檢測。

第十四頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六

進行植物表達載體構建時，根據(jù)所選載體的內(nèi)切酶位點進行準確設計是工作的關鍵；但是這種僅僅基于分子生物學常識的設計不一定能保證成功，還有許多未知因素影響實驗工作，能及時發(fā)現(xiàn)問題及并進行再次的合理設計有助于加快工作進度。

第十五頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六三）植物表達載體構建實例

第十六頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六1、質(zhì)粒

構建含不同啟動子的植物表達載體，用到pUCpepc、pSCL0041、pUC19、pBI121四個不同的質(zhì)粒。

第十七頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六1）pUCpepc:為pUC19克隆載體，經(jīng)XbaI內(nèi)切酶位點插入甘蔗C4Ppc基因，抗性為Amp，由張木清研究員提供。

2）pBI121：植物表達載體，內(nèi)含gus和nptII基因,啟動子為35S,終止子為nospoly(A)，由本所陳平華博士提供。

第十八頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六3)pUC19:克隆載體，用于構建含2x35S啟動子和35Spoly(A)載體，從華美公司購買。

4)pSCL0041植物表達載體:在左右邊界內(nèi)含有hyg和帶內(nèi)含子的gus基因，且各自帶有35S啟動子和35Spoly(A)、nospoly(A)。外源基因的啟動子為2x35S，終止子為35Spoly(A)

。

第十九頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六2、工具酶

1）限制性內(nèi)切酶;

2）T4DNA連接酶;

3）RNaseA;

4）CAIP;

5)TaqDNA聚合酶

;第二十頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六第二十一頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六第二十二頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六第二十三頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六第二十四頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六第二十五頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六第二十六頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六第二十七頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六第二十八頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六第二十九頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六二、植物遺傳轉(zhuǎn)化研究進展

第三十頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六1、遺傳轉(zhuǎn)化效率

轉(zhuǎn)化效率因轉(zhuǎn)化再生體系與之相結合的轉(zhuǎn)化方法，造成許多作物的轉(zhuǎn)化植株出現(xiàn)嵌合體與育性問題，導致遺傳轉(zhuǎn)化效率比較低。

第三十一頁，共三十三頁，編輯于2023年，星期六

從理論上講，一個好的遺傳轉(zhuǎn)化體系應能解決嵌合體及育性問題。即受體再生系