蛋白質(zhì)純化的方法

蛋白質(zhì)純化的方法、局限性及展望姓名：杜改亮學(xué)號(hào):201020945專業(yè)：細(xì)胞生物學(xué)摘要：相對(duì)與上游工作來(lái)說(shuō)，分子克隆的下游工作顯得更難，蛋白純化工作非常復(fù)雜，除了要保證純度外，蛋白產(chǎn)品還必須保持其生物學(xué)活性。純化工藝必須能夠每次都能產(chǎn)生相同數(shù)量和質(zhì)量的蛋白，重復(fù)性良好。這就要求應(yīng)用適應(yīng)性非常強(qiáng)的方法而不是用能得到純蛋白的最好方法去純化蛋白。在實(shí)驗(yàn)室條件下的好方法卻可能在大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用中失敗，因?yàn)楹笳咭笠?guī)?；以诿咳盏膽?yīng)用中要有很好的重復(fù)性。本文綜述了蛋白質(zhì)純化方法優(yōu)點(diǎn)及局限性，以期對(duì)蛋白純化的方法選擇及整體方案的制定提供一定的指導(dǎo)，并提出展望。關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)的純化方法； 局限性； 展望引言蛋白純化要利用不同蛋白間內(nèi)在的相似性與差異，利用各種蛋白間的相似性來(lái)除去非蛋白物質(zhì)的污染，而利用各蛋白質(zhì)的差異將目的蛋白從其他蛋白中純化出來(lái)。每種蛋白間的大小、形狀、電荷、疏水性、溶解度和生物學(xué)活性都會(huì)有差異，利用這些差異可將蛋白從混合物如大腸桿菌裂解物中提取出來(lái)得到重組蛋白。蛋白的純化大致分為粗分離階段和精細(xì)純化階段二個(gè)階段。粗分離階段主要將目的蛋白和其他細(xì)胞成分如DNA、RNA等分開(kāi)，由于此時(shí)樣本體積大、成分雜，要求所用的樹(shù)脂高容量、高流速，顆粒大、粒徑分布寬.并可以迅速將蛋白與污染物分開(kāi)，防止目的蛋白被降解。精細(xì)純化階段則需要更高的分辨率，此階段是要把目的蛋白與那些大小及理化性質(zhì)接近的蛋白區(qū)分開(kāi)來(lái)，要用更小的樹(shù)脂顆粒以提高分辨常用的離子交換柱和疏水柱,應(yīng)用時(shí)要綜合考慮樹(shù)脂的選擇性和柱效兩個(gè)因素。選擇性指樹(shù)脂與目的蛋白結(jié)合的特異性，柱效則是指蛋白的各成分逐個(gè)從樹(shù)脂上集中洗脫的能力，洗脫峰越窄，柱效越好。僅有好的選擇性，洗脫峰太寬，蛋白照樣不能有效分離。各種蛋白純化方法及優(yōu)缺點(diǎn)1.1硫酸銨沉淀蛋白蛋白能溶于水是因?yàn)槠浔砻嬗杏H水性氨基酸。在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)處若溶液的離子強(qiáng)度特別高或特別低，蛋白則傾向于從溶液中析出。硫酸銨是沉淀蛋白質(zhì)最常用的鹽，因?yàn)樗诶涞木彌_液中溶解性好，冷的緩沖液有利于保護(hù)蛋白的活性。硫酸銨分餾常用做純化的第一步，它可以初步粗提蛋白質(zhì)，去除非蛋白成分。蛋白質(zhì)在硫酸銨沉淀中較穩(wěn)定，可以短期在這種狀態(tài)下保存中間產(chǎn)物，當(dāng)前蛋白質(zhì)純化多采用這種辦法進(jìn)行粗分離翻。在規(guī)模化生產(chǎn)上硫酸銨沉淀方法仍存在一些問(wèn)題，硫酸銨對(duì)不銹鋼器具的腐蝕性很強(qiáng)。其他的鹽如硫酸鈉不存在這種問(wèn)題，但其純化效果不如硫酸銨。除了鹽析外蛋白還可以用多聚物如PEG和防凍劑沉淀出來(lái)，PEG是一種惰性物質(zhì)，同硫酸銨一樣對(duì)蛋白有穩(wěn)定效果，在緩慢攪拌下逐漸提高冷的蛋白溶液中的PEG濃度，蛋白沉淀可通過(guò)離心或過(guò)濾獲得，蛋白可在這種狀態(tài)下長(zhǎng)期保存而不損壞。蛋白沉淀對(duì)蛋白純化來(lái)說(shuō)并不是多么好的方法，因?yàn)樗荒苓_(dá)到幾倍的純化效果，而我們?cè)谶_(dá)到目的前需要上千倍的純化。其好處是可以把蛋白從混雜有蛋白酶和其他有害雜質(zhì)的培養(yǎng)基及細(xì)胞裂解物中解脫出來(lái)。1.2離子交換色譜這是在所有的蛋白純化與濃縮方法中最有效方法?；诘鞍着c離子交換樹(shù)脂間的相互電荷作用，通過(guò)選擇不同的緩沖液，同一種蛋白既可以和陰離子交換樹(shù)脂（能結(jié)合帶負(fù)電荷的分子）結(jié)合，也可以和陽(yáng)離子交換樹(shù)脂結(jié)合。樹(shù)脂所用的帶電基團(tuán)有四種：二乙基氨基乙基用于弱的陰離子交換樹(shù)脂；羧甲基用于弱的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂；季銨用于強(qiáng)陰離子交換樹(shù)脂；甲基磺酸酯用于強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂。蛋白質(zhì)由氨基酸組成，氨基酸在不同的pH環(huán)境中所帶總電荷不同。大多數(shù)蛋白在生理pH（pH6—8）下帶負(fù)電荷，需用陰離子交換柱純化，極端的pH下蛋白會(huì)變性失活.應(yīng)盡量避免。由于在某個(gè)特定的pH下不同的蛋白所帶電荷數(shù)不同，與樹(shù)脂的結(jié)合力也不同，隨著緩沖液中鹽濃度的增加或pH的變化，蛋白按結(jié)合力的強(qiáng)弱被依次洗脫。在工業(yè)化生產(chǎn)中更多地是改變鹽濃度而不是去改變pH值，因?yàn)榍罢吒菀卓刂?。在?shí)驗(yàn)室中幾乎總是用鹽濃度梯度去洗脫離子交換柱，利用泵的輔助可以使流入柱的緩沖液中鹽濃度平穩(wěn)地上升，當(dāng)離子強(qiáng)度能夠中和蛋白的電荷時(shí)，蛋白就被從柱上洗脫下來(lái)。但在工業(yè)生產(chǎn)中鹽濃度很難精確控制，所以常用分步洗脫而不足連續(xù)升高的鹽梯度。與排阻層析相比，離子交換特異性更好，有更多的參數(shù)可以調(diào)整以獲得最優(yōu)的純化效果，樹(shù)脂也比較便宜。值得一提的是，即便是用最精確控制的條件，僅用離子交換單一的方法也得不到純的蛋白，還需要其他的純化步驟。1.3親和層析親和層析基于目的蛋白與固相化的配基特異結(jié)合而滯留，其他雜蛋白會(huì)流過(guò)柱子。本方法存在的問(wèn)題是：?jiǎn)慰狗浅０嘿F，而且也需先純化；單抗與目的蛋白結(jié)合力太強(qiáng).要用苛刻的條件來(lái)洗脫，這會(huì)使目的蛋白失活并破壞單抗；混合物中的其他蛋白如蛋白酶也可能破壞抗體或與它們非特異結(jié)合；某些單抗也會(huì)在純化過(guò)程中從樹(shù)脂上解離下來(lái)混入產(chǎn)物中，也需要從終產(chǎn)物中去除。親和柱通常在純化過(guò)程的后期應(yīng)用，此時(shí)標(biāo)本體積已縮小，大部分的雜質(zhì)已經(jīng)去除。谷胱甘肽S一轉(zhuǎn)移酶(GlutathioneS—transferase,GST)是最常用的親和層析純化標(biāo)簽之一，帶有此標(biāo)簽的重組蛋白可用交聯(lián)谷胱甘肽的層析介質(zhì)純化，但本方法有以下缺點(diǎn)：首先，蛋白上的GST必須能合適地折疊，形成與谷胱甘肽結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)才能用此方法純化；其次，GST標(biāo)簽多達(dá)220個(gè)氨基酸，如此大的標(biāo)簽可能會(huì)影響表達(dá)蛋白的可溶性，使形成包涵體，這會(huì)破壞蛋白的天然結(jié)構(gòu)，難于進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，有時(shí)即便純化后再酶切去除GST標(biāo)簽也不一定能解決問(wèn)題。另一種可應(yīng)用的親和純化標(biāo)簽是6組氨酸標(biāo)簽，組氨酸的咪唑側(cè)鏈可親和結(jié)合鎳、鋅和鉆等金屬離子，在中性和弱堿性條件下帶組氨酸標(biāo)簽的目的蛋白與鎳柱結(jié)合，在低pH下用咪唑競(jìng)爭(zhēng)洗脫。組氨酸標(biāo)簽與GST相比有許多優(yōu)點(diǎn)，首先，由于只有6個(gè)氨基酸，分子量很小，一般需要酶切去除：其次，可以在變性條件下純化蛋白，在高濃度的尿素和胍中仍能保持結(jié)合力；另外6組氨酸標(biāo)簽無(wú)免疫原性，重組蛋白可直接用來(lái)注射動(dòng)物，也不影響免疫學(xué)分析。雖然有這么多的優(yōu)點(diǎn)，但此標(biāo)簽仍有不足，如目的蛋白易形成包涵體、難以溶解、穩(wěn)定性差及錯(cuò)誤折疊等。鎳柱純化時(shí)金屬鎳離子容易脫落漏出混入蛋白溶液，不但會(huì)通過(guò)氧化破壞目的蛋白的氨基酸側(cè)鏈，而且柱子也會(huì)非特異吸附蛋白質(zhì)，影響純化效果。若目的蛋白可與某種碳水化合物特異結(jié)合，或者需要某種特殊的輔因子，可將該碳水化合物或輔因子固相化制成親和柱，結(jié)合后目的蛋白可用高濃度的碳水化合物或輔因子洗脫。1.4疏水作用層析蛋白是由疏水性和親水性氨基酸組成’的。疏水性氨基酸位于蛋白空間結(jié)構(gòu)的中心部位，遠(yuǎn)離表面的水分子。親水性氨基酸殘基則位于蛋白表面。由于親水性氨基酸吸引了許多的水分子，所以通常情況下整個(gè)蛋白分子被水分子包圍著，疏水性氨基酸不會(huì)暴露在外。在高鹽濃度的環(huán)境中蛋白的疏水性區(qū)域則會(huì)暴露并與疏水性介質(zhì)表面的疏水性配基結(jié)合。不同的蛋白疏水性不同，與疏水作用力大小也不同，通過(guò)逐漸降低緩沖液中鹽濃度沖洗柱子，在鹽濃度很低時(shí)，蛋白恢復(fù)自然狀態(tài)，疏水作用力減弱被洗脫出來(lái)。疏水性樹(shù)脂的選擇性是由疏水性配基的結(jié)構(gòu)決定的，常用的直鏈配體為烷基配體(alkylligands)和芳基配體(arylligands)，鏈越長(zhǎng)結(jié)合蛋白的能力也越強(qiáng)。理想樹(shù)脂種類的選擇應(yīng)根據(jù)目的蛋白的化學(xué)性質(zhì)而定，不能選擇結(jié)合力太強(qiáng)的樹(shù)脂，結(jié)合力太強(qiáng)的樹(shù)脂會(huì)很難洗脫，所以開(kāi)始時(shí)應(yīng)選用中等結(jié)合力的苯基樹(shù)脂探討條件。為了使選擇合適的介質(zhì)更容易AmershamBiosciences推出了疏水作用樹(shù)脂選擇試劑盒，里面包括5種不同的樹(shù)脂供比較。疏水層析很適合作為離子交換純化的下一個(gè)步驟，因?yàn)槭杷饔脤游鲈诟啕}濃度下上樣，從離子交換得到的產(chǎn)物不需更換緩沖液即可使用。蛋白又在低鹽緩沖液中洗脫，又省去了下一步純化前的更換緩沖液的步驟，既節(jié)約了時(shí)間，又減少了蛋白的丟失。1.5排阻層析也叫凝膠過(guò)濾或分子篩排阻層析柱的填充顆粒是多孔的介質(zhì)，柱中圍繞著顆粒所能容納的液體量叫流動(dòng)相，也稱無(wú)效體積。太大的蛋白不能進(jìn)入顆粒的孔內(nèi)，只能存在于無(wú)效體積的溶液中，將會(huì)最早從柱中洗脫出來(lái)，對(duì)這部分蛋白無(wú)純化效果。由于各種蛋白的分子大小不同，擴(kuò)散進(jìn)入特定大小孔徑顆粒內(nèi)的能力也各異。大的蛋白分子會(huì)被先洗脫出來(lái)，分子越小，洗脫出來(lái)的越晚。為得到最佳的純化效果，應(yīng)將孔徑大小選在目的蛋白能在無(wú)效體積和總柱床體積的中點(diǎn)附近洗脫。排阻層析有其他方法所不具備的優(yōu)點(diǎn)，首先所能純化的蛋白分子量范圍寬，TosohBiosep公司的聚合物樹(shù)脂，排阻極限可達(dá)20o000kD；其次，樹(shù)脂微孔的形狀適合分離球形的蛋白質(zhì)，純化過(guò)程中也不需要能引起蛋白變性的有機(jī)溶劑。應(yīng)該注意的是某些蛋白不適合用凝膠過(guò)濾純化，因?yàn)楸炯夹g(shù)所用樹(shù)脂有輕度的親水性，電荷密度較高的蛋白容易吸附在上面。排阻層析從不用于純化過(guò)程的早期，因?yàn)檫@種方法要求標(biāo)本高度濃縮，上樣量只能在柱體積的1%--4%之間，柱子要細(xì)而長(zhǎng)才能得到好的分離效果，樹(shù)脂本身也比較昂貴，規(guī)模化的工業(yè)生產(chǎn)中不太適用。另外近幾年還出現(xiàn)一些對(duì)蛋白質(zhì)方法的改進(jìn)的方法,如：內(nèi)含肽介導(dǎo)的新型蛋白質(zhì)純化技術(shù)；反膠束用于蛋白質(zhì)純化。—些實(shí)例應(yīng)用2008年的內(nèi)含肽介導(dǎo)的新型蛋白質(zhì)純化技術(shù)內(nèi)含肽的自切割功能在蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，尤其是在蛋白質(zhì)純化方面，將內(nèi)含肽與親和純化技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，使得傳統(tǒng)的親和純化方式有了重大的突破。近年來(lái)，隨著內(nèi)含肽的研究不斷深入，一批內(nèi)含肽介導(dǎo)的新型蛋白質(zhì)純化技術(shù)不斷出現(xiàn)。新技術(shù)依靠?jī)?nèi)含肽的自切割功能去除親和標(biāo)簽，避免了傳統(tǒng)工藝中因外加蛋白酶而帶來(lái)的諸多麻煩；新的聚合材料的引入又成功地避開(kāi)了親和樹(shù)脂柱的使用，不僅優(yōu)化了工藝，也大大降低了純化的成本，為在工業(yè)化大生產(chǎn)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。2009年的2種棉花葉片總蛋白質(zhì)純化方法比較研究以三氯乙酸一丙酮沉淀法粗提的棉花總蛋白為材料，比較了丙酮沉淀法、醋酸銨沉淀法純化棉花總蛋白的效果.結(jié)果顯示：與三氯乙酸一丙酮沉淀法提取的棉花總蛋白干粉加入裂解液后直接電泳相比較，經(jīng)丙酮沉淀法和醋酸銨沉淀法處理后的總蛋白雜質(zhì)干擾少、電泳結(jié)果蛋白條帶清晰，蛋白含量較高，相比醋酸銨沉淀法丙酮沉淀法效果較好，適合于棉花蛋白質(zhì)組學(xué)研究中純化總蛋白質(zhì).2010年的ProteinA/G親和層折在HCV抗體^化中的應(yīng)用效果目的：分析蛋白A/G親和層析柱在純化抗HCV血清的影響因素，以便選擇最佳使用條件提高ProteinA/G親和柱的利用效率。方法：分別將抗HCV血清用不同處理方式、不同上樣方式、不同使用次數(shù)的親和柱進(jìn)行純化，并收集純化樣品進(jìn)行檢測(cè)、分析。結(jié)果：用飽和硫酸銨粗純后，在蛋白A/G親和層析柱的純化效果更好；樣品在親和柱內(nèi)吸附30min可提高親和柱的對(duì)目的蛋白的吸附。結(jié)論：使用初純的抗體并增加吸附時(shí)間能提高親和層析柱的利用率，并有效延長(zhǎng)親和柱的使用壽命。蛋白質(zhì)純化方法的進(jìn)化與展望近年來(lái)隨著各學(xué)科的迅猛發(fā)展，對(duì)蛋白純化技術(shù)的需求不斷增長(zhǎng)，已有的純化方法被日益改進(jìn)，新型的純化方法也相繼涌現(xiàn)。羥磷灰石是磷酸鈣的結(jié)晶，由于其理化性質(zhì)不夠穩(wěn)定，結(jié)合能力差，很難用于層析。進(jìn)來(lái)Bio-Rad公司對(duì)其進(jìn)行了改進(jìn)，提高了鈣和磷的比例，使形成球形、多孔、性質(zhì)穩(wěn)定的陶瓷羥磷灰石顆粒,其帶正電的鈣離子和負(fù)電性的磷酸根離子可分別與蛋白的羧基及氨基結(jié)合。通過(guò)調(diào)整緩沖液的pH值，酸性及堿性氨基酸可選擇性地與此樹(shù)脂結(jié)合，改變緩沖液的鹽濃度可將蛋白洗脫分離。資料顯示，使用這種方法能使兩種等電點(diǎn)、分子量和疏水性相同的蛋白很好分離”q。親和純化方面，SigrIla發(fā)展了利用FLAG標(biāo)簽的純化方法，F(xiàn)IAG序列為N—AspTyrLysAspAspAspAsp—Lys—C,分子量小且親水性，與其融合表達(dá)的蛋白不易形成包涵體，活性也不受影響，用該公司抗FLAG抗體親和樹(shù)脂即可純化目的蛋白。其他新型標(biāo)簽及相應(yīng)純化系統(tǒng)還有CBP(Calmodulin—bindingpeptide,CBP)、Promega公司的BCCP(Biotincarboxy—kaIIierprotein,BCCP)標(biāo)簽和親和素一生物素純化系統(tǒng)、麥芽糖結(jié)合蛋白(Maltose_bindingprotein,MBP)標(biāo)簽、Biolabs公司的IMPACT—CN系統(tǒng)、Novagen公司的CBD-tag和T7—tag系統(tǒng)等。相信隨著時(shí)間的推移，會(huì)有更多更好的方法出現(xiàn)，合理充分地應(yīng)用這些方法，對(duì)科研、生物制藥、疫苗、診斷試劑研制等工作都會(huì)有很大幫助。參考文獻(xiàn)汪小雄，盧龍斗，李明軍等.日本落葉松胚性愈傷組織蛋白組分雙向電泳分析[J].河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2009,37(1):116-122.ZhaoZetal.ApplMicrobiolBiotechno2008,77(5):1175-1180.MeeCetal.ChemEngJ2008,135(1):56-62.金宇.反膠束中酶催化反應(yīng)研究進(jìn)展[J].化學(xué)工程,2008,24(4):33-35.LanJ,ZhangY,HuangX,etal.Improvementofthecatalyticperformanceofligninperoxidaseinreversedmicelles[J].ChemTechnolBiotechnol,2008,83:64-70.V.C.Lombardi,F.W.Ruscetti,J.DasGupta,M.A.Pfost,K.S.Hagen,D.L.Peterson,S.K.Ruscetti,R.K.Bagni,C.Petrow-Sadowski,B.Gold,M.Dean,R.H.Silverman,J.A.Mikovits,DetectionofaninfectiousretrovirusXMRV,inbloodcellsofpatientswithchronicfatiguesyndrome,Science326(2009)585-589.J.L.Humann,B.K.Schroeder,M.W.Mortimer,B.L.House,S.N.Yurgel,S.C.Maloney,K.L.Ward,H.M.Fallquist,H.T.Ziemkiewicz,M.L.Kahn,ConstructionandexpressionofsugarkinasetranscriptionalgenefusionsbyusingtheSinorhizobiummelilotiORFeome,Appl.Environ.Microbiol.74(2008)6756-6765.R.Hopkins,D.Esposito,ArapidmethodfortitratingbaculovirusstocksusingtheSf-9easytitercellline,Biotechniques47(2009)785-788.J.L.Hartley,G.F.Temple,M.A.Brasch,DNAcloningusinginvitrosite-specificrecombination,GenomeRes.10(2000)1788-1795.T.C.Terwilliger,D.Stuart,S.Yokoyama,Lessonsfromstructuralgenomics,Annu.Rev.Biophys.38(2009)371-383.J.L.Markley,D.J.Aceti,C.A.Bingman,B.G.Fox,R.O.Frederick,S.Makino,K.W.Nichols,G.N.PhillipsJr,J.G.Primm,S.C.Sahu,F.C.Vojtik,B.F.Volkman,R.L.Wrobel,Z.Zolnai,Thecenterforeukaryoticstructuralgenomics,J.Struct.Funct.Genomics10(2009)165-179.陳鵬，侯智法.苦養(yǎng)種子萌發(fā)過(guò)程蘆丁降解酶的代謝規(guī)律[