第三節(jié)基因工程載體

第三節(jié)基因工程載體第一頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一本章重點掌握的內容掌握載體、克隆載體、表達載體、穿梭載體、質粒、α-互補、插入失活、人工染色體載體的概念。克隆載體DNA分子具備的條件。標記基因的分類及其作用。pBR322、pUC18/19質粒載體的組成、優(yōu)點及質?？寺≥d體用途。λ-DNA載體的構建、類型及其優(yōu)點。植物表達載體的組成、啟動子的類型等第二頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一

遺傳物質+載體

重組的DNA分子引入細胞或生物體內復制與表達穩(wěn)定地遺傳給下代第三頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一DNA：

1）獨立的一個包括啟動子（promoter)、編碼區(qū)（encodingregion)和終止子（terminator)的基因，or組成基因的某個元件，一般是不可以進入受體細胞的；

2）采用理化方法進入細胞后，也不容易在受體細胞內維持。所以，通過不同途徑能將承載的外源DNA片段帶入受體細胞，并在其中得以維持的DNA分子稱為基因工程載體。第四頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一載體（vector)是由在細胞中能夠自主復制的DNA分子構成的一種遺傳成分；基因工程中，攜帶目的基因進入宿主細胞進行擴增和表達的工具稱為載體。目的基因能否有效轉入受體細胞，并在其中維持高效表達，在很大程度上決定于載體。第三節(jié)基因工程載體第五頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一載體的功能載體的功能運送外源基因高效轉入受體細胞為外源基因提供復制能力或整合能力為外源基因的擴增或表達提供必要的條件第六頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一

載體的要求A、復制起點：能在受體中復制；B、篩選標記；C、限制性內切酶切割位點；D、載體的大?。涸瓌t上要求載體越小越好；E、適當的拷貝數；F、載體的安全性：質粒不能隨便轉移;G、外源基因的表達：啟動子。第七頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一大腸桿菌質粒載體pBR322結構圖

復制起點

遺傳標記基因克隆位點克隆位點第八頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一載體的分類按功能分類克隆載體克隆一個基因或DNA片斷表達載體用于一個基因的蛋白表達整合載體把一個基因插入到染色體組中按來源分類

質粒載體噬菌體載體柯斯質粒載體人工染色體載體第九頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一載體的種類和特征質粒*受體細胞結構插入片斷舉例

E.coli環(huán)狀＜

8kbpUC18/19,T-載體等

λ噬菌體E.coli線狀9-24kbEMBL系列，λgt系列絲狀噬菌體及噬菌粒E.coli環(huán)狀＜

10kbM13mp系列粘粒載體E.coli環(huán)狀35-45kbpJB8,c2RB,pcoslEMBL,pWE15/16,pCVBAC(BacterialArtificialChromosome)E.coli環(huán)狀≈300kbPeloBAC系列YAC(YeastArtificialchromosome)酵母細胞線性染色體100-2000kbMAC(MammalianArtificialChromosome)哺乳類細胞線性染色體＞

1000kb病毒載體動物細胞環(huán)狀SV40載體，昆蟲桿狀病毒載體穿梭載體動物細胞和細菌環(huán)狀pSVK3質粒，PBV,Ti質粒第十頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一一、

克隆載體第十一頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一一、質粒載體1.質粒的概念質粒（plasmid)是一種存在于細菌或真菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子,可自身復制和表達。

并不是寄主生長所必需的，但可以賦予寄主某些抵御外界環(huán)境因素不利影響的能力（帶有抗性基因等）。

分子量在1-200kb之間。第十二頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一一、質粒載體大腸桿菌的質粒第十三頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一一、

質粒載體2.質粒的空間構型①共價閉合環(huán)狀DNA（CovalentclosecircularDNA，cccDNA)呈超螺旋（SC）（supercoil）

第十四頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一一、

質粒載體②

開環(huán)DNA（

opencircular，

ocDNA）一條鏈上有一至數個缺口。

③

線形DNA（

linear，LDNA）第十五頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一一、

質粒載體同一質粒盡管分子量相同，不同的構型電泳遷移率不同：

SCDNA最快、LDNA次之、OCDNA最慢。

SC

OC

L

第十六頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一一、

質粒載體3.質粒的基本特性

質粒的自主復制性質粒能利用寄主細胞的DNA復制系統進行自主復制。質粒DNA上的復制子結構決定了質粒與寄主的對應關系。根據在每個細胞中的分子數（拷貝數）多寡，質?？煞譃閮纱髲椭祁愋停簢谰o型（復制控制的）質粒（stringentplasmid）

(拷貝數少，為1-5個)和松弛型（復制控制的）質粒（relaxed）

(拷貝數多，可達10-200個拷貝)因此，作為載體的質粒應該是松弛型的。質粒

復制子

拷貝數

pBR322及其衍生質粒

pMB115～20pUC系列質粒及其衍生質粒

突變的

pMB1500～700pSC101及其衍生質粒pSC101～5ColE1ColE115～20第十七頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一一、質粒載體質粒的不相容性(incompatibility,又稱質粒的不親和性)

兩個質粒在同一宿主中不能共存的現象稱質粒的不相容性。具有不相容性的質粒組成的群體稱為不相容群，一般具有相同的復制子。

以大腸桿菌的質粒為例：

ColE1、pMB1擁有相似的復制子結構，彼此不相容

pSC101、F、RP4擁有相似的復制子結構，彼此不相容

p15A及其衍生質粒擁有相似的復制子結構，彼此不相容

第十八頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一一、

質粒載體攜帶特殊的遺傳標記

野生型的質粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標記基因，這使得寄主生物產生正常生長非必需的附加性狀，包括：

物質抗性

抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機物

物質合成

抗生素、細菌毒素、有機堿

這些標記基因對DNA重組分子的篩選具有重要意義第十九頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一一、

質粒載體遺傳標記基因

定義:在基因工程中使用與選擇重組體DNA轉化細胞的基因標記基因的作用

1.指示外源DNA分子（載體或重組分子）是否進入宿主細胞

2.指示外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子

第二十頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一一、

質粒載體標記基因的種類

1.抗性標記基因（可直接用于選擇轉化子）

a.

抗生素抗性基因:Apr

，Tcr，Cmr，Kanr，G418r，Hygr

，Neorb.重金屬抗性基因:Cur

，Znr

，Cdrc.代謝抗性基因:TK，抗除草劑基因

2.營養(yǎng)標記基因（可直接用于選擇轉化子）

主要是參與氨基酸，核苷酸及其他必需營養(yǎng)物合成酶類的基因，

這類基因在酵母轉化中使用最頻繁，如TRP1，URA3，LEU2，HIS4等。

3.生化標記基因

其表達產物可催化某些易檢測的生化反應，如lacZ，GUS，CAT4.噬菌斑第二十一頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一一、

質粒載體第二十二頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一一、

質粒載體抗藥性標記選擇(插入失活法)

第二十三頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一

第二十四頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一一、

質粒載體pBR322重組克隆的篩選第二十五頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一pBR322質粒載體優(yōu)點：

第一，具有較小的分子量——4363bp。第二，具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉化子的選擇記號。

第三，具較高的拷貝數，而且經過氯霉素擴增之后，每個細胞中可累積1000～3000個拷貝。一、

質粒載體第二十六頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一pUC系列質粒載體pUC質粒載體（包括四個部分）：(i)來自pBR322質粒的復制起點（ori）；(ii)氨芐青霉素抗性基因（ampr）；(iii)大腸桿菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的啟動子及其編碼α-肽鏈的DNA序列，此結構特稱為lacZ’基因；(iv)位于lacZ’基因中的靠近5’-端的一段多克隆位點（MCS）區(qū)段，外源基因插入后破壞了lacZ’基因的功能。第二十七頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一10個連續(xù)的單一限制酶切位點，但它不破壞該基因功能。第二十八頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一第二十九頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一α-互補：pUC類載體帶有l(wèi)acz’基因，編碼半乳糖苷酶氨基端片段（α-肽），此片段與宿主細胞所編碼的羧基端半乳糖苷酶實現基因內互補，形成有功能的半乳糖苷酶，稱α-互補。第三十頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一一、

質粒載體第三十一頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一一、

質粒載體X-galX-gal-peptideC-terminusofb-galactosiase

+第三十二頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一一、

質粒載體互補顯色反應

第三十三頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一一、

質粒載體α-互補(α-complementation)

第三十四頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一一、

質粒載體

pUC質粒載體的優(yōu)點：具有較小的相對分子質量和更高的拷貝數，平均每個細胞可達500-700個拷貝。適用于組織化學方法檢測重組體，有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ’基因，所編碼的-肽鏈可參與-互補作用，在IPTG誘導和底物X-gal存在下，形成藍色和白色菌落篩選重組體。具有MCS區(qū)段，便于外源基因的克隆。第三十五頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一一、

質粒載體常用的遺傳標記基因

葡萄糖苷酸酶基因（GUS）

該基因編碼一種可分解各種β-葡萄糖苷酸酶基因衍生物的水解酶。該標記基因除具有上述lacZ基因的優(yōu)點外，它的適用范圍十分廣泛，因為許多生物中沒有這種基因。

熒光素酶基因

熒光素酶或由螢火蟲產生的可催化蜜蜂熒光素氧化的酶，并產生熒光，若在反應中加入CoA，可使靈敏度提高10倍；或由發(fā)光細菌產生的熒光素酶，它與FMN-氧化還原酶聯用，通過NAD(P)H的變化測定酶活。

發(fā)光蛋白質基因

發(fā)光蛋白是由水母產生的一種可發(fā)光的蛋白質，該蛋白質可使大腸桿菌菌落呈藍色。

第三十六頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一一、

質粒載體4.質粒的命名原則人工組建的質粒

人工組建的質粒的第一個字母是質粒英文名字（plasmid）的第一個字符p，用小寫。p后有2個字母是大寫，表示質粒的作者和實驗室名稱，再其后為質粒的編號。如pBR322，字母p代表質粒，BR是構建該質粒的研究人員的姓名，322代表…構建的一系質粒的編號。第三十七頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一一、

質粒載體（3）穿梭質粒載體(shuttlevector)：這種質粒分子上含有兩個親緣關系不同的復制子結構以及相應的選擇性標記基因，因此能在兩種不同種屬的受體細胞中復制并檢測，如大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質粒、大腸桿菌-酵母菌穿梭質粒等。第三十八頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一二、噬菌體載體

噬菌體（Bacteriophage）它本身是一種核蛋白，核心是一段DNA(線性)，結構上有一個蛋白質外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細菌內。第三十九頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一二、噬菌體載體

噬菌體或病毒的DNA能被開發(fā)成為基因工程的有用載體，因為：

1.高效率的感染性能使外源基因高效導入受體細胞；

2.自主復制繁殖性能使外源基因在受體細胞中高效擴增。第四十頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一二、噬菌體載體(一)λ噬菌體的生物學特性

λ噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體；λ噬菌體由外殼包裝蛋白和λ-DNA組成；λDNA在噬菌體中是線狀DNA分子，全長

48.502kb雙鏈DNA，60多個基因，其中有1/3的區(qū)域是其裂解性生長的非必需區(qū)，這一區(qū)段的缺失，或在此區(qū)段中插入外源DNA，并不影響噬菌體的增殖，這就是λ噬菌體可作為基因載體的依據

。

cos位點（cohesiveendsite):在DNA兩端各有12nt的5`單鏈突出(5‘-GGGCGGCGACCT-3’)，彼此序列互補。它是包裝時的切割信號。第四十一頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一二、噬菌體載體(一)λ噬菌體的生物學特性λ噬菌體的生活周期第四十二頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一二、噬菌體載體

λ噬菌體：雙鏈DNA溫和噬菌體DNA大小約為50kb粘性末端：12bp的互補單鏈

當λ噬菌體進入寄主細胞內后,其粘性末端能通過堿基互補作用,形成環(huán)狀DNA分子。粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱為cos位點,它是包裝蛋白的識別位點,λ噬菌體的包裝與DNA特性和其它序列無關,但對包裝的DNA大小有要求,包裝范圍大約在36kb-51kb。

第四十三頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一二、噬菌體載體λ噬菌體作為構建載體材料的依據：

λ噬菌體是一種溫和噬菌體；能承載比較大的外源DNA片段；在λ噬菌體分子上有許多限制性核酸酶識別位點，便于多種DNA酶切片段的克隆。第四十四頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一二、噬菌體載體(二)構建λ噬菌體的基本原理

(1)λ噬菌體的缺陷：

基因組太大（48.5kb）；

酶切點太多，它有5個BamH1位點（G↓GATCC），6個BgⅠ位點（A↓GATCT），5個EcoRⅠ位點（G↓AATTC）。

野生型只能接納一定長度的DNA。若相當于λ噬菌體的75-105%。

重組的λDNA分子難于直接導入宿主細胞—利用體外包裝成病毒顆粒，然后通過感染的方法注入DNA。第四十五頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一二、噬菌體載體(三)構建λ噬菌體的基本內容

構建λ噬菌體克隆載體的基本策略：

切去部分非必須的區(qū)域；抹去多余的限制性內切酶切割位點；插入可供選擇的標記基因；建立體外包裝系統。第四十六頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一二、噬菌體載體選擇標記

(1)加裝選擇標記imm434imm434基因編碼一種阻止λ-噬菌體進入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標記基因的λ-載體進入受體細胞后，建立溶原狀態(tài)，細菌生長緩慢，形成渾濁斑；當外源DNA插入到標記基因中，基因滅活，λ-重組分子便進入溶菌循環(huán)，形成透明斑。

第四十七頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一二、噬菌體載體選擇標記

(2)加裝選擇標記lacZLacZ基因編碼β-半乳糖苷酶，能催化無色的X-gal生成藍色化合物。當外源基因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能合成藍色化合物；而空載體λ-DNA則產生藍色透明斑。

第四十八頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一二、噬菌體載體(四)λ噬菌體載體的類型（1）插入型載體

只有1～2種限制性核酸內切酶的單一切割位點

大腸桿菌β-半乳糖苷酶失活

第四十九頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一二、噬菌體載體（1）插入型載體

載體長度37kb插入位點體外包裝插入片段大?。?-14kb（51–37）插入片段體外包裝第五十頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一二、噬菌體載體(四)λ噬菌體載體的類型（2）替換型載體

在其中央部位有一個可以被外源插入的DNA分子取代的DNA片段的克隆載體

。這是由于構建此載體時，安排在中央可取代片段兩側的多克隆位點是反向重復序列，因此，當外源DNA插入時，一對克隆位點之間的DNA片段便會被置換掉，從而有效提高了克隆外源DNA片段的能力。如：

λEMBL3第五十一頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一第五十二頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院二、噬菌體載體第五十三頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一二、噬菌體載體插入型載體替換型載體第五十四頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一二、噬菌體載體(五)常用的λ噬菌體載體

（一）β－半乳糖苷失活插入型載體（二）免疫功能失活插入型載體（三）Charon系列取代型載體（四）λEMBL系列取代型載體（五）Spi-正選擇取代型載體（六）

λZAP插入型載體

第五十五頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一λDNA復制早期：一個ori，雙向復制晚期：滾環(huán)復制--多個λDNA分子形成線狀多聯體第五十六頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一

頭部包裝蛋白首先結合在cos區(qū)的附近，形成包裝啟動復合物，A蛋白切割cos位點。包裝E第五十七頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一二、噬菌體載體(六)Lambda噬菌體載體的克隆原理及步驟

第五十八頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一二、噬菌體載體(七)λ-DNA重組分子的體外包裝體外包裝原理：

λ噬菌體的頭部和尾部的裝配是分開進行的。頭部基因發(fā)生了突變的噬菌體只能形成尾部和頭部蛋白所需的蛋白因子；尾部基因發(fā)生了突變的噬菌體則只能形成頭部和尾部蛋白所需的蛋白因子。將這兩種突變型的噬菌體的提取物混合起來，便能夠在體外裝配成有生物活性的噬菌體顆粒。第五十九頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一第六十頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一二、噬菌體載體λ-DNA作為載體的優(yōu)點

λ-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉染大腸桿菌λ-DNA載體的裝載能力為25kb，遠遠大于質粒的裝載量重組λ-DNA分子的篩選較為方便重組λ-DNA分子的提取較為簡便λ-DNA載體適合克隆和擴增外源DNA片段，但不適合表達外源基因

第六十一頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一二、噬菌體載體單純以噬菌體為基礎構建的載體:裝載量大，能排斥空載體，轉染效率高,操作較難，DNA不穩(wěn)定。單純以質粒為基礎構建的載體:有天然的抗性選擇標記，操作容易（易于分離和轉化），較穩(wěn)定,裝載量小，轉化效率較低；第六十二頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一三、噬菌體-質粒雜合載體(一)柯斯質粒載體

這是一類用于克隆大片段DNA的載體，它是由λ噬菌體的cos（cohesive）末端及質粒（plasmid）重組而成的載體。cosmid載體帶有質粒的復制起點、克隆位點、選擇性標記以及λ噬菌體用于包裝的cos末端等，因此該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組DNA導入受體細胞。但它不會產生子代噬菌體，而是以質粒DNA的形式存在于細胞內。第六十三頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一三、噬菌體-質粒雜合載體柯斯質粒載體的基本特點

具有λ噬菌體的特性(體外包裝，高效感染等)；具有質粒載體的特性(易于克隆操作、選擇及高拷貝等)；具有較高容量（45kb）的克隆能力；具有與同源性序列的質粒進行重組的能力。

不能體內包裝，不裂解受體細胞，在細胞內不能形成噬菌體顆粒，因而不能形成噬菌斑。第六十四頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一三、噬菌體-質粒雜合載體柯斯質粒載體的構建第六十五頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一三、噬菌體-質粒雜合載體應用柯斯質粒載體進行基因克隆的一般程序第六十六頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一三、噬菌體-質粒雜合載體柯斯質粒載體的克隆原理及步驟

1．分離外源DNA片段35～45kb2．外源DNA與兩個粘粒相連，且cos方向相同

3．體外包裝：在的A蛋白的功能作用下切割cos位點并將其中的DNA包裝到成熟的噬菌體顆粒中去

4．感染E.coli：線狀的重組DNA被注入細胞并通過cos位點的環(huán)化，而形成粘粒載體，象質粒一樣復制第六十七頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一四、人工染色體及其應用

人類、動物、植物的全基因組序列分析往往需要克隆數百甚至上千kb的DNA片段，

此時考斯質粒(45kb)和噬菌體的裝載量也遠遠不能滿足需要。

將細菌接合因子或酵母菌染色體上的復制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質粒組裝在一起，即可構成染色體載體。當大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，

它能像天然染色體那樣，在受體細胞中穩(wěn)定的復制并遺傳。

或稱為自主復制序列(ARS)第六十八頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一四、人工染色體及其應用

人工染色體載體（artificialchromosomevector）:利用染色體的復制元件來驅動外源DNA片段復制的載體。

實際上是一種“穿梭”克隆載體，含有質?？寺≥d體所必備的第一受體(大腸桿菌)源質粒復制起始位點(ori)，還含有第二受體(如酵母菌)染色體DNA著絲點、端粒和復制起始位點的序列，以及合適的選擇標記基因。與其他的克隆載體相比，人工染色體克隆載體的特點是能容納長達1000kb甚至3000kb的外源DNA片段。

第六十九頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一四、人工染色體及其應用

(一)酵母人工染色體

酵母人工染色體(yeastartificialchromosome，YAC)是一類酵母穿梭載體。

YAC具有自主復制序列、克隆位點以及可在細菌和酵母菌中選擇的標記基因?？梢越邮?50-400kb的外源DNA片段。

四膜蟲的端粒序列

酵母染色體的復制子

酵母染色體的中心粒序列

酵母系統的選擇標記

大腸桿菌的復制子

大腸桿菌的選擇標記第七十頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一四、人工染色體及其應用(一)酵母人工染色體酵母人工染色體的使用第七十一頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一四、人工染色體及其應用(一)酵母人工染色體酵母人工染色體的使用pYAC3第七十二頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一四、人工染色體及其應用

用pYAC3進行克隆策略如下：

載體用BamHI和SnaBI雙酶切，形成3個片段。

移去BamHI之間的片段，留下另外兩段，每一段的兩端都分別是TEL序列和SnaBI位點。

被克隆的DNA，兩端必須切成平末端(SnaBI是一個平末端內切酶，識別TACGTA序列)。

把三者連接起來，形成了人工染色體。

用原生質轉化的方法把人工染色體轉入釀酒酵母。用作宿主的菌株是雙營養(yǎng)缺陷型Trp1-ura3-

，可以被人工染色體上的篩選標記基因恢復成Trp1+ura3+

。

在基本培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，只有含有結構正確的人工染色體的轉化體可以生存。

如果染色體構建錯誤，如在被克隆的DNA兩側連接了相同的兩段載體DNA片段，則因缺少一種篩選標記，使得轉化體不能在基本成分培養(yǎng)基上存活。

外源DNA的是否插入，可由SUP4的插入失活判斷，即可以很簡單地由菌落的顏色看出：紅色的菌落是重組體，而白色的菌落則不是。第七十三頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一四、人工染色體及其應用(二)細菌人工染色體

細菌人工染色體通常是在大腸桿菌性因子F質粒的基礎上構建的，其裝載量范圍在50-300kb之間。

pBACs主要適用于：克隆大型基因簇（genecluster）結構

構建動植物基因文庫

缺點：會出現插入片段在結構上的不穩(wěn)定，導致克隆DNA部分的缺失或重排。第七十四頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一四、人工染色體及其應用(三)P1派生人工染色體

結合了

P1載體和

BAC載體的最佳特性，包括陽性選擇標記

sacB及噬菌體

P1的質粒復制子和裂解性復制子。

(四)哺乳動物人工染色體

第七十五頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一

第二節(jié)

表達載體第七十六頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一第二節(jié)

表達載體克隆載體（cloningvector）：主要是對目的基因克隆，建立DNA文庫和cDNA文庫，其上有復制子即可；表達載體（expressionvector）：能使目的基因在宿主細胞中表達的一類載體。這類載體既有復制子，更要有強啟動子；穿梭載體（shuttlevector）：這類載體可以在原核細胞中復制，也可在真核細胞中擴增和表達。第七十七頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一第二節(jié)

表達載體第七十八頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一第二節(jié)

表達載體表達載體構建的一般原則

1.閱讀框架與外源基因高效表達

2.啟動子與外源基因高效表達

3.轉錄的有效延伸和終止與外源基因高效表達

4.有效的翻譯起始與外源基因高效表達

5.終止密碼子選擇與外源基因高效表達

6.外源蛋白的穩(wěn)定性與外源基因高效表達第七十九頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院第二節(jié)

表達載體真核基因在原核細胞中表達，載體必須具備的條件：⑴載體能夠獨立復制，具有復制起點。⑵應具有靈活的克隆位點和方便的篩選標記，以利于外源基因的克隆鑒定和篩選。⑶應具有很強的啟動子，能為大腸桿菌RNA聚合酶所識別。⑷應具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當誘導時才能進行轉錄。⑸應具有很強的終止子，只轉錄克隆的基因，所產生的mRNA較為穩(wěn)定。⑹所產生的mRNA必須具有翻譯的起始信號AUG和SD序列，以便轉錄后順利翻譯。第八十頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院第二節(jié)

表達載體大腸桿菌表達載體的基本成分第八十一頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院第二節(jié)

表達載體啟動子：影響表達效率的主要因素之一是啟動子的強弱。常見啟動子見下表。啟動子的強弱取決于啟動子本身的序列，尤其是—10和—35區(qū)的堿基組成及彼此的間隔長度，同時也與啟動子和外源基因轉錄起始位點間的距離有很大關系。復制子：一段包含復制起始位點的DNA片段。Ecoli.質粒常見的有pMB1、ColE1等。第八十二頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院第二節(jié)

表達載體啟動子-35區(qū)序列-10區(qū)序列PlacTTTACATATAATPtrpTTGACATTAACTPtacTTGACATATAATPtraATAGACATAATGT

PlLTTGACA

GATACT

PrecATTGATA

TATAAT啟動子第八十三頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院第二節(jié)

表達載體

最佳啟動子具備的條件：

第一必須是強啟動子第二啟動子應能呈現出一種低限的基礎轉錄水平第三啟動子應是誘導型的（熱或化學誘導）第八十四頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院第二節(jié)

表達載體強化轉錄終止的必要性

外源基因在強啟動子的控制下表達，容易發(fā)生轉錄過頭現象，過長轉錄物的產生在很大程度上會影響外源基因的表達。終止子

強終止子的選擇與使用

目前外源基因表達質粒中常用的終止子是來自大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2以及T7噬菌體DNA上的Tf。

對于一些終止作用較弱的終止子，通常可以采用二聚體終止子串聯的特殊結構，以增強其轉錄終止作用。第八十五頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院第二節(jié)

表達載體

外源基因在大腸桿菌細胞中的高效表達不僅取決于轉錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關。大腸桿菌細胞中結構不同的mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時可高達數百倍。mRNA翻譯的起始效率主要由其5‘端的結構序列所決定，稱為核糖體結合位點（RBS）核糖體結合位點第八十六頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院第二節(jié)

表達載體大腸桿菌核糖體結合位點包括下列四個特征結構要素：

位于翻譯起始密碼子上游的6–8個核苷酸序列5’UAAGGAGG3’，即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16SrRNA3’端區(qū)域3’AUUCCUCC5’并與之專一性結合，將mRNA定位于核糖體上，從而啟動翻譯；

翻譯起始密碼子

大腸桿菌絕大部分基因以

AUG作為閱讀框架的起始位點，有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子；

SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成基因編碼區(qū)5’端若干密碼子的堿基序列核糖體結合位點第八十七頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院第二節(jié)

表達載體

不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質編碼基因，對簡并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性。密碼子生物體對密碼子的偏愛性密碼子偏愛性對外源基因表達的影響

由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個重要因素是密碼子的正確選擇。構建Ecoli.表達載體時要考慮所表達基因的種類和性質，或對外源基因的堿基進行適當置換，或對克隆載體上的調控序列進行適當調整。第八十八頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院第二節(jié)

表達載體第八十九頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院第二節(jié)

表達載體第九十頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院第二節(jié)

表達載體第九十一頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院第二節(jié)

表達載體類型:

Ⅰ型：轉錄起始區(qū)（調控序列+啟動子）+終止子

Ⅱ型:轉錄起始區(qū)終止子

+翻譯起始區(qū)（核糖體結合序列和起始密碼子）+終止子

Ⅲ型:轉錄起始區(qū)

+翻譯起始區(qū)

+信號肽鏈編碼區(qū)

+終止子（常稱之為表達分泌型載體）第九十二頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院第二節(jié)

表達載體

三種表達型載體結構圖第九十三頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院一、質粒表達載體(一)原核表達載體

適用于在原核細胞中表達外源基因的載體

1.原核表達載體的表達元件

啟動子

轉錄終止子

核糖體結合位點（SD序列）

表達方式：

組成型表達

誘導型表達

融合型表達

分泌型表達

第九十四頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院一、質粒表達載體

融合型表達載體

PSDForeignDNA融合型表達載體融合基因(一)原核表達載體第九十五頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院一、質粒表達載體Ptac：IPTG誘導GST融合蛋白—直接純化產物切割方便：

pGEX-1T—凝血酶

pGEX-2T---凝血酶

pGEX-3T---X因子位相載體

融合型表達載體

(一)原核表達載體第九十六頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院一、質粒表達載體(一)原核表達載體分泌型表達載體1、主要元件：啟動子和SD序列信號肽序列：SD下游，編碼信號肽，可引導蛋白跨膜2、優(yōu)點：分泌表達，避免降解。

第九十七頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院一、質粒表達載體

(二)酵母表達載體

原核生物和真核生物存在翻譯后修飾反應機制的差異，

真核基因在原核表達系統中難以獲得有活性的蛋白。

酵母是真核表達的首選系統

酵母表達載體是一種穿梭表達載體：既能在大腸桿菌中繁殖，又能在酵母中復制、表達和選擇。

第九十八頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院一、質粒表達載體

(二)酵母表達載體DNA復制起始區(qū)（含兩類復制起始序列）選擇標記（營養(yǎng)缺陷型或顯性選擇標記）有絲分裂穩(wěn)定區(qū)表達盒(啟動子、分泌信號序列、終止子等)第九十九頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院一、質粒表達載體

(二)酵母表達載體第一百頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院一、質粒表達載體(二)酵母表達載體第一百零一頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院一、質粒表達載體(三)Ti質粒表達載體

1.天然Ti質粒的結構與及其致瘤功能

Ti質粒（tumorinducingplasmid)是根癌農桿菌中可引發(fā)植物產生瘤狀物的質粒，是環(huán)狀雙鏈DNA。

根據誘導植物產生的冠癭堿的不同可分為：

章魚堿型（octopine）胭脂堿型（nopaline）農桿堿型（agropine）農桿菌素堿型（agrocinopine）[或稱琥珀堿型（succinamopine）]

其實這些Ti質粒合成不同的冠癭堿外，在基因結構上也有一定的差異第一百零二頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院一、質粒表達載體農桿菌與植物細胞相互作用的機制第一百零三頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院一、質粒表達載體TiPlasmid：

已知農桿菌附著到植物細胞后，只留在細胞間隙中。T-DNA首先在細菌中被加工、剪切、復制，然后轉入植物細胞。第一百零四頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院一、質粒表達載體(三)Ti質粒表達載體

1.天然Ti質粒的結構與及其致瘤功能

毒性區(qū)（vir區(qū)）：激活T-DNA的轉移

T-DNA區(qū)：侵染植物時，從Ti質粒上被切割，轉移到植物細胞中，帶有與腫瘤形成有關的基因接合轉移區(qū)（Con區(qū)）：存在與細菌間進行接合有關的基因復制起始區(qū)（Ori區(qū)）：

保證Ti質粒進行自我復制第一百零五頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院一、質粒表達載體(三)Ti質粒表達載體

2.Ti質粒表達載體

利用T-DNA可攜帶DNA片段并整合到植物基因組的特性，對天然Ti質粒進行改造，用于植物轉基因載體。

一元表達載體

雙元表達載體第一百零六頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院一、質粒表達載體(三)Ti質粒表達載體

2.Ti質粒表達載體

一元表達載體【也稱為共整合載體（cointegratevectors）系統】

需要同源重組才能插入外源基因。

pGV3850是一種受體質粒，外源基因不能直接插入，而是需要借助于pBR322質粒作為中間載體。第一百零七頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院一、質粒表達載體(三)Ti質粒表達載體

2.Ti質粒表達載體

一元表達載體外源基因插入pGV3850的過程第一百零八頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院一、質粒表達載體第一百零九頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院一、質粒表達載體(三)Ti質粒表達載體

2.Ti質粒表達載體

雙元表達載體：由兩個分別含有T-DNA和Vir區(qū)的相容性突變Ti質粒構成的系統。

輔助Ti質粒：含有Vir區(qū)，用于激活T-DNA的轉移

（由經改靠的農桿菌提供EHA105、LBA4404)

含

T-DNA的微型質粒：是一種穿梭載體。

第一百一十頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院一、質粒表達載體第一百一十一頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院一、質粒表達載體一元載體雙元載體（反式載體）第一百一十二頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院一、質粒表達載體(四)動物質粒表達載體第一百一十三頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院二、病毒表達載體

表達載體元件有：

源于病毒的啟動子和增強子；

病毒

的復制子序列以及所需的反式作用因子編碼基因；

polyA加尾信號

病毒載體可應用于：

外源蛋白的真核表達

基因治療

多價、多聯活載體疫苗的研制

基因功能的鑒定第一百一十四頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院二、病毒表達載體(一)桿狀病毒表達載體

(二)腺病毒表達載體第一百一十五頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院二、病毒表達載體(三)反轉錄病毒載體(四)SV40病毒型轉化載體第一百一十六頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院第三節(jié)

特殊用途的載體（自學）第一百一十七頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院一、插入或定點整合突變載體(一)基因定點插入/基因敲除載體

(二)隨機插入突變載體

1.T-DNA插入突變載體

2.轉座子插入突變載體第一百一十八頁，共一百二十八頁，編輯于2023年，星期一生命科學學院二、啟動子探針型表達載體

特點：

具有一個無啟動子的易檢測的基因。這種基因必須滿足一個重要條件：基因編碼區(qū)5